陈龙
- 作品数：23 被引量：83H指数：5
- 供职机构：郧阳医学院附属东风医院更多>>
- 发文基金：湖北省自然科学基金湖北省科技攻关计划湖北省教育厅重点项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 鼠尾胶在小鼠外周血间充质干细胞分离培养中的作用被引量：4
- 2008年
- 背景:动物和人外周血中分离出的间充质干细胞生长繁殖受分离方法、培养条件等因素的影响。目的:采用重组人粒细胞集落刺激因子动员小鼠外周血间充质干细胞,体外培养条件中加入鼠尾胶包被,观察其对细胞分离、培养、增殖的影响。设计、时间及地点:开放性实验,于2005-05/2007-12在郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所完成。材料:昆明小鼠20只随机分为鼠尾胶包被组和不包被对照组,每组10只。方法:小鼠皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子80μg/(kg·d)连续动员5d,最后一次注射后6h取外周血。肝素抗凝后,采用全血细胞分离培养,用含体积分数为0.15胎牛血清DMEM培养基,分别接种于包被和未包被鼠尾胶的12孔板,接种密度为1×105/孔,48h后半量换液以后每3天换液1次,培养10d。主要观察指标:①鼠尾胶包被的培养板对形成成纤维样细胞集落的影响。②成纤维样细胞集落中的间充质干细胞表面标记流式检测结果。③成纤维样细胞集落成骨、成脂肪诱导后嗜银法和油红O法染色鉴定。结果:①使用鼠尾胶包被的培养板可增加重组人粒细胞集落刺激因子动员后外周血成纤维样细胞集落出现的频率(P<0.05)。②经流式细胞术鉴定形成成纤维样细胞集落的细胞不表达CD34、CD133,表达CD90、CD105。③成骨、成脂肪诱导后细胞嗜银法和油红O法染色鉴定均呈阳性。结论:培养的细胞符合公认间充质干细胞的特征,鼠尾胶可增加培养皿的黏附性促进间充质干细胞分离。
- 刘岐焕陈龙程范军唐俊明王家宁高清平
- 关键词：间充质干细胞集落形成单位测定粒细胞集落刺激因子
- 重组人粒细胞集落刺激因子促进骨髓间充质干细胞增殖被引量：12
- 2006年
- 目的探讨重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)对小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖的影响。方法将昆明小鼠随机分为2组(n=15),G-CSF组采髓前皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)80μg·kg-1·d-1,连用5d,对照组皮下注射等量生理盐水。每组分别于最后一次注射后6h、12h及7d(168h)取小鼠骨髓,分离、培养MSCs,计数成纤维样细胞集落形成单位(CFU-F)的个数;应用流式细胞仪检测单个核细胞(MNCs)细胞周期及CFU-F细胞表面抗原特征。结果应用rhG-CSF后,培养MNCs所获得的CFU-F数目增加(P<0.01),CFU-F数与取材时间(6h、12h、7d)呈负相关(P<0.05),但12h取材者与7d取材者比较,CFU-F数目的差异无统计学意义(P>0.05)。MNCs培养形成的CFU-F,其细胞表面抗原呈CD34-、CD133-、CD90+、CD105+,分别占2.5%、3.1%、67.0%和78.0%。G-CSF组各时间点获得的MNCs,其G0/G1期细胞百分率较对照组低(P<0.05),而S+G2/M期增高(P<0.05),且6h取材者S+G2/M期细胞百分率明显高于12h和7d取材者(P<0.05)。结论rhG-CSF可促进骨髓MNCs进入细胞增殖周期,增殖的高峰在应用G-CSF后6h左右。
- 刘岐焕程范军高清平陈龙唐俊明王家宁
- 关键词：间质干细胞细胞周期细胞增殖
- 红细胞生成素对骨髓源间充质干细胞迁移的影响被引量：1
- 2008年
- 目的利用Transwell体外迁移体系初步探索EPO在骨髓源间充质干细胞（MSC）迁移中的作用及其信号传递机制。方法采用经典的全骨髓细胞贴壁法培养MSC，通过成骨、成脂肪等多向诱导分化以及流式细胞术分析其表面标志（CD133、CD34、CD90、CD105）等鉴定MSC特征；以第3代MSC为实验材料，利用Transwell体外迁移体系，先观察不同浓度的rhEPO对MSC迁移的影响，随后在50nm0L／L Wortmannin、50μmoL／LPD98059、10μmoL／LU73122、4μg／ml抗EPO—R IgG、30μmol/LSB203580、10mmol／L Straurosporine、6nmol/L G0697、50μmol/L Pseudo Z等不同的信号转导途径阻断剂的干预下观察EPO对迁移的影响。结果培养的MSC呈现出CD90、CD105强阳性，具有成骨、成脂肪等多向分化能力；MSC体外迁移能力随着rhEP0浓度（1、10、100、1000IU／ml）的递增而逐渐增强，并且rhEP0浓度在100U／ml时，MSC迁移到滤膜上的细胞数接近于峰值；Wortmannin、PD98059、抗EPO—RIgG、Straurosporine、G06976、Pseudoz对MSC迁移均有影响，其中U73122、抗EPO—RIgG、Straurosporine、PseudoZ对MSC迁移阻断的效应最显著。结论EPO—EPO—R所介导的MSC迁移与丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C和蛋白激酶C-ζ（PKC-ζ）等信号传递途径有关，且PKC-ζ途径可能处于中心环节。
- 陈龙程范军唐俊明张卫国刘歧焕曾琴兵孔霞郭凌郧王家宁
- 关键词：间充质干细胞迁移蛋白激酶C信号转导
- 细菌内同源重组快速构建和制备表达hSDF-1α的重组腺病毒被引量：8
- 2007年
- 目的:利用细菌内同源重组快速构建携带hSDF-1αcDNA重组腺病毒质粒和制备表达hSDF-1α重组腺病毒.方法:制备感受态BJ5183,将pAdEasy-1转化BJ5183,制备含pAdEasy-1的BJ5183感受态,将线性化的pShuttle-EGFP-hS-DF-1α转化含pAdEasy-1的BJ5183感受态菌.采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒pAd-EGFP-hSDF-1α.pAd-EG-FP-hSDF-1α用PacI线性化后,再用LipoVec介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒,采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒Ad-EGFP-hSDF-1α.采用荧光显微镜下观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况.结果:pShuttle-EGFP-hSDF-1α成功地转化了含pAdEasy-1的BJ5183,并在其内发生了同源重组.荧光显微镜下观察证实了pAd-EGFP-hSDF-1α转染AD293后,产生了重组腺病毒Ad-EGFP-hSDF-1α.病毒滴度为4.1×1015pfu/L.结论:用细菌内同源重组法可快速、高效制备表达hSDF-1α的高滴度重组腺病毒.为研究hSDF-1α在动员骨髓源干细胞迁移到组织损伤部位修复组织损伤的研究奠定了基础.
- 唐俊明郭凌郧孔霞杨建业潘国栋陈龙黄永章王家宁
- 关键词：同源重组腺病毒基因治疗
- 人基质细胞衍生因子-1对骨髓间充质干细胞增殖的影响被引量：7
- 2008年
- 目的:探索人基质细胞衍生因子-1(SDF-1)对间充质干细胞(MSC)增殖的影响.方法:采用经典的全骨髓贴壁法培养MSC,通过成骨、成脂肪等多向诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记(CD133,CD34,CD90,CD105)等鉴定MSC特征;以P3-MSC为实验材料,采用H3-TdR参入法分析SDF-1对MSC增殖的影响.以50 nmol/L渥曼青霉素,10mmol/L LY294002,50 mmol/L PD98059,0.1g/L AMD3100等分别处理P3-MSC,观察SDF-1影响MSC增殖的信号机制.结果:培养的MSC呈现出CXCR4,CD90和CD105强阳性,具有成骨、成脂肪等多向分化能力;含有100 mg/L SDF-1的20mL/L促进了MSC增殖,而含有100 mg/L SDF-1的150 mL/LFBS抑制了MSC增殖.SDF-1抑制MSC增殖的效应与其使MSC停滞在G1/S期有关.促分裂原活化蛋白激酶P38MAPK阻断剂SB203580和CXCR4阻断剂AMD3100取消了SDF-1抑制MSC增殖的效应,而细胞外信号调节激酶阻断剂PD98059加强了SDF-1抑制MSC增殖的效应.结论:SDF-1/CXCR4介导的抑制MSC增殖的效应与促分裂原活化蛋白激酶和细胞外信号调节激酶等信号分子有关.
- 孔霞唐俊明郭凌郧杨建业陈龙黄永章王家宁
- 关键词：间充质干细胞增殖促分裂原活化蛋白激酶
- hSDF-1α/CXCR4介导骨髓源间充质干细胞迁移的信号转导被引量：5
- 2007年
- 目的:利用Boyden chamber体外迁移体系初步探索基质细胞衍生因子-1(SDF-1)在骨髓源间充质干细胞(MSC)迁移中的作用及其信号转导机制.方法:采用经典的全骨髓贴壁法培养MSC,通过成骨、成脂肪等多向诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记(CD133,CD34,CD90,CD105)等鉴定MSC特征;以P3-MSC为实验材料,利用Boyden chamber体外迁移体系,观察不同浓度的hSDF-1对MSC迁移的影响,以50nmol渥曼青霉素,10mmol LY294002,50mmol PD98059,10mmol U73122,0.1g/L AMD3100等不同处理P3-MSC,观察最适宜浓度的hSDF-1对MSC迁移影响的信号转导机制.结果:培养的MSC呈现出CD90,CD105强阳性,具有成骨、成脂肪等多向分化能力;MSC体外迁移能力随着hSDF-1α浓度(1,10,100,500μg/L)的递增而逐渐增强,并且hSDF-1α浓度在100μg/L时,MSC迁移到滤膜上的细胞数接近于峰值;渥曼青霉素,LY294002,PD98059,U70312,AMD3100,维拉帕米对MSC迁移均有影响,其中U73122,AMD3100对MSC迁移阻断的效应最显著.结论:SDF-1/CXCR4所介导的MSC迁移与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK),磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C和蛋白激酶C(PKC)等信号途径有关,且PKC途径可能处于中心环节.
- 王新均唐俊明孔霞郭凌郧杨建业郑飞陈龙黄永章王家宁
- 关键词：间充质干细胞迁移蛋白激酶C信号转导
- 骨髓间充质干细胞成纤维样集落的培养方法及多向分化潜能被引量：2
- 2006年
- 目的:建立原代小鼠骨髓间充质干细胞成纤维样集落的培养方法,了解间充质干细胞的培养特性及其多向分化潜能。方法:实验于2004-10/2005-10在郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所完成。①间充质干细胞的分离:选取SPF级2月龄昆明种小鼠30只,无菌条件下抽取双侧股骨、胫骨骨髓,制成骨髓单细胞悬液,计数有核细胞的密度。②血清浓度对成纤维样集落的影响:调整有核细胞密度为5×108L-1,分别接种于体积分数为0.02,0.05,0.1,0.15,0.2,0.25的胎牛血清-DMEM培养基中,每种血清浓度各4孔,1mL/孔,24h后换液。随后每72h换液,连续观察2周。③有核细胞密度对成纤维样集落的影响:分别调整有核细胞至106L-1,107L-1,2.5×108L-1,5×108L-1,109L-1,分别接种于12孔板中,每种密度4孔,24h后换液。随后每72h换液,连续观察2周,瑞氏吉姆萨染色后计数成纤维样集落的个数。④成骨与成脂肪诱导:调整有核细胞密度在5×108L-1,接种于预包被鼠尾胶的12孔板中培养。24h换液,去除未贴壁的细胞,以后每48h换液1次,换液后加入成骨诱导液、成脂肪诱导液。观察各血清浓度下细胞生长情况,消化培养板中的成纤维样集落流式细胞仪检测CD34,CD133,CD90,CD105。VonKossa和油红O法染色鉴定间充质干细胞成骨与成脂肪诱导情况。结果:①不同血清浓度对成纤维样集落形成的影响:胎牛血清-DMEM培养液体积分数为0.02,0.05时,细胞可保持成纤维样,但增殖较慢;体积分数为0.15,0.2,0.25时,细胞增殖较快,但细胞易分化;体积分数为0.1时,细胞可基本保持成纤维样,且增殖速度适中。②有核细胞不同接种密度对成纤维样集落形成的影响:有核细胞接种密度为106L-1,107L-1时,每孔成纤维样集落数为0～1个。接种密度高于109L-1时,每孔成纤维样集落之间出现交叉或融合。接种密度分别为2.5×108L-1,5×108L-1,109L-1时,10d左右可见典型的成纤维样集落。�
- 刘岐焕程范军高清平陈龙唐俊明王家宁
- 关键词：骨髓细胞间质细胞集落形成单位测定
- 重组人红细胞生成素促进体外培养的人骨髓间充质干细胞增殖被引量：1
- 2008年
- 为了观察重组人红细胞生成素(rhEPO)对人骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖活性的影响,抽取健康志愿者的骨髓液,贴壁培养获取第3代细胞,通过细胞形态特征、细胞表面抗原及诱导分化的方法进行MSCs鉴定;取经过鉴定的第3代MSC(P3-MSC)加入不同浓度rhEPO(0.5、1、5、10、50U/ml)后培养,应用细胞计数法及MTT法检测细胞增殖,用流式细胞术(FCM)分析细胞周期。结果发现:骨髓贴壁培养获取的第3代细胞同时表达CD105和CD90,不表达CD34和CD45,并可被诱导分化为脂肪、骨及软骨细胞,被鉴定为MSC。MTT结果显示EPO处理组的光密度值(OD)均高于对照组(p<0.05);50U/ml浓度EPO组作用最显著,细胞计数法获得的结果与其一致。FCM细胞周期分析表明,rhEPO能明显降低G0/G1期细胞比例,并提高S+G2/M期细胞比例,与对照组相比,差异均具有显著统计学意义(p<0.01)。结论:EPO能促进体外培养的人骨髓MSCs增殖,该效应与EPO调节其进入细胞增殖周期有关。
- 曾琴兵程范军张卫国唐俊明陈龙刘歧焕高清平王家宁
- 关键词：红细胞生成素间充质干细胞细胞周期
- rhG-CSF对小鼠骨髓间充质干细胞的动员作用被引量：5
- 2007年
- 为了研究rhG-CSF体内应用对小鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的动员作用,将30只小鼠随机分为2组:rhG-CSF组和对照组,分别给予皮下注射rhG-CSF80μg/(kg.d)和等量生理盐水,连续5天,在最后1次注射后分别于6,12和168小时取小鼠骨髓和外周血,以1×106单个核细胞(MNC)接种于12孔培养板14天,对形成的成纤维细胞集落(CFU-F)进行计数,用胰蛋白酶消化后应用流式细胞术测定表面抗原并进行成脂,成骨诱导。结果表明:rhG-CSF组骨髓形成的CFU-F数均较对照组明显增加(p<0.01)。6小时取材较12小时,168小时取材形成的CFU-F数目多(p<0.01),12小时与168小时CFU-F差异无统计学意义。流式细胞术检测骨髓CFU-F显示CD34-、CD133-、CD90+、CD105+,骨髓CFU-F具有成脂、成骨分化的能力。rhG-CSF组6小时取材外周血具有类似骨髓的CFU-F,出现的频率为(0.50±0.11)×10-6,与对照组比较差异有显著性(p<0.05)。结论:rhG-CSF可使小鼠骨髓间充质干细胞增殖加速,但时间短暂,其高峰在rhG-CSF应用5天后的6小时内。rhG-CSF对小鼠间充质干细胞也有动员能力,但作用较弱。
- 刘岐焕程范军陈龙唐俊明王家宁高清平
- 关键词：重组人粒细胞集落刺激因子骨髓间充质干细胞CFU-F
- rhEPO和rhG-CSF对小鼠CD90^+细胞的动员作用
- 2009年
- 目的:探讨重组人促红细胞生成素(rhEPO)和重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)对小鼠外周血CD90+细胞的动员作用。方法:30只雄性昆明小鼠随机分为对照组、rhG-CSF组和rhEPO组。rhG-CSF 40μg.kg-1.d-1、rhEPO 250 IU.kg-1.d-1连续皮下注射5 d;对照组连续皮下注射生理盐水。每组均于最后一次注射后6 h收集外周血,计数有核细胞(ANC)和单个核细胞(MNC),流式细胞仪检测外周血ANC中CD90+、CD34+CD90+和CD90+CD34-细胞的比例。结果:应用rhG-CSF和rhEPO动员后,小鼠外周血中ANC和MNC的数量均较对照组增加(P<0.05),但rhG-CSF和rhEPO两组之间无差异(P>0.05)。流式细胞术检测显示rhEPO组外周血ANC中CD90+细胞比例为(56.49±9.06)%,较rhG-CSF组明显增加(P<0.05);而rhG-CSF组和对照组CD90+细胞占ANC的比例无明显差异(P>0.05)。rhEPO组的CD90+CD34-细胞比例增至(53.5±8.9)%,占CD90+细胞中绝大多数。结论:rhEPO和rhG-CSF均有较强的造血干细胞动员能力,但rhEPO对CD90+细胞的动员作用强于rhG-CSF,提示rhEPO对早期造血干细胞可能具有更强的动员作用。
- 郑芳陈龙程范军刘岐焕张有顺邹灿
- 关键词：促红细胞生成素粒细胞集落刺激因子
