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耿美玲: 作品数：10 被引量：35H指数：4; 供职机构：中国人民解放军南京军区军事医学研究所更多>>; 发文基金：国家自然科学基金南京军区医学科技创新课题江苏省自然科学基金更多>>; 相关领域：医药卫生农业科学生物学化学工程更多>>

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2型猪链球菌89K毒力岛Ⅳ型分泌系统LAMP检测方法的建立被引量：11: 2014年; 目的建立针对高致病性2型猪链球菌（Streptococcus suis 2，SS2）89K毒力岛Ⅳ型分泌系统的环介导等温扩增（100p-mediated isothermal amplification，LAMP）方法。方法根据国内流行株特有89K毒力岛编码的Ⅳ型分泌系统（T4SS-89K）的virB4-89K基因保守区域设计并合成LAMP引物，通过优化反应体系和扩增条件建立T4SS-89K快速检测方法，对方法的特异性、敏感性进行评估。结果优化的LAMP反应体系具有良好的扩增效率，检测灵敏度为1．53×10^-1拷贝／反应，全部扩增检测可在60rain内完成；建立的LAMP法具有良好的特异性，与不含T4SS-89K的猪链球菌（包括1／2型、1型、3-33型），以及其他常见9种对照菌均不发生特异性扩增，而与1998和2005年疫情现场分离的高致病性SS2均可发生特异性扩增。结论建立的LAMP方法具有特异、灵敏，设备要求简单等特点，可用于高致病性SS2快速检测。; 张凤玉胡丹吕恒张锦海郝丽娜龚秀芳操敏郑峰耿美玲朱进李丙军潘秀珍王长军

2型猪链球菌菌毛亚蛋白tSSU0473的原核表达与免疫学特性: 为了研究2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype2,S.suis2)野毒株05ZYH33的菌毛亚蛋白SSU0473的免疫保护作用,PCR法扩增出tSSU0473部分基因片段,将目的基因克隆到表...; 耿美玲张先云胡丹潘秀珍王长军; 关键词：原核表达; 文献传递

汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立被引量：8: 2014年; 目的通过建立汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法,快速准确地检测汉坦病毒。方法根据汉滩型和汉城型汉坦病S片段基因的序列分别设计特异性探针引物,使用含有目的基因片段的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立检测两型汉坦病毒的实时荧光定量PCR方法。结果建立的检测方法特异性良好,与其他常见病原不发生交叉反应;最低检测限为101copies/μl,灵敏度高;不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与Ct值之间线性关系表达式分别为y=-3.4607x+40.988(HTN),y=-3.5307x+39.356(SEO),扩增效率分别为92.2%(HTN)和92.6%(SEO),相关系数R2分别为0.9968(HTN)和0.9997(SEO),呈良好的线性关系,且重复性好。结论建立的实时荧光定量PCR灵敏度高,重复性好,可用于汉坦病毒的快速检测,并可初步辨别汉滩型和汉城型汉坦病毒,对肾综合征出血热的病原早期诊断和流行病学调查有较好的应用价值。; 胡丹郝丽娜李丙军张锦海吕恒张凤玉龚秀芳耿美玲谭维国操敏郑峰朱进姚苹苹张云王长军; 关键词：汉坦病毒荧光定量PCR

恙虫病东方体环介导恒温扩增可视化快检方法的建立被引量：3: 2013年; 目的建立快速检测恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi,Ot)的环介导恒温扩增技术(Loop-mediated iso-thermal amplification,LAMP),以期用于基层医院及疫区恙虫病快速筛查。方法以恙虫病东方体56ku外膜蛋白基因为检测靶序列,设计2组恒温扩增引物,筛选最佳引物,优化反应条件,对多种培养物中的Ot标准株及地方株进行验证检测,以经典PCR检测为对照,评估LAMP检测方法的敏感性和特异性。结果建立的LAMP法可快速检测鸡胚培养物、动物脏器及病人血样中的Ot DNA,经63℃恒温扩增1h之后,即可肉眼或用浊度仪观察结果,其他5种立克次体DNA模板对照,均无特异性扩增。LAMP法测定Ot DNA的最低限为5.3×101拷贝/反应,普通PCR法为5.3×104拷贝/反应,LAMP法比普通PCR提高约3个数量级。结论建立的LAMP法能快速检测多种样品中的Ot 56ku基因,方法的灵敏度和特异性高,实现了检测的可视化,适用于基层医院及疫区恙虫病筛查。; 耿美玲操敏张锦海吕恒胡丹郑峰朱进潘秀珍王长军; 关键词：恙虫病东方体灵敏度特异性可视化

恙虫病东方体合肥分离株截短56kDa蛋白抗原表达及活性分析: 2014年; 本文获得恙虫病东方体合肥分离株截短56kDa外膜蛋白基因工程纯化抗原，并鉴定其免疫学活性，为进一步研制广谱诊断试剂、疫苗以及分析其在东方体致病的分子机制奠定基础。我们通过DNA Star和Mega等软件对含有440个氨基酸的合肥株56kDa蛋白序列进行抗原性分析；将合肥株56kDa截短蛋白基因克隆至原核表达载体pET28a获重组质粒，转入大肠杆菌E．coli BL21感受态中，经IPTG诱导，SDS—PAGE电泳分析检测蛋白表达；采用亲和层析法纯化目的蛋白，Western-blot及ELISA法鉴定其免疫学活性。序列分析发现合肥分离株56kDa蛋白可分为4个保守区和3个可变区，抗原性分析结果显示，其保守区的亲水性和抗原性均有很高峰值。SDS—PAGE电泳显示约56kDa的目的重组蛋白表达条带，Western—blot分析显示该重组蛋白可与恙虫病病人血清反应，阴性血清则未出现相应印迹，ELISA分析结果显示该蛋白最低浓度为80ng／μL时仍可检出阳性血清；5μg／mL蛋白可检测阳性血清滴度高达1：12800，证实其具有较强反应原性。本实验获得恙虫病东方体合肥株56kDa截短外膜蛋白基因工程抗原具有良好的抗原活性，有望进一步应用于恙虫病的诊断、疫苗研制及致病机制分析。; 耿美玲郑峰吕恒朱进胡丹郝丽娜张凤玉龚秀芳李丙军李先富潘秀珍王长军操敏; 关键词：恙虫病东方体抗原性基因表达

2型猪链球菌菌毛结构亚蛋白tSSU0473的原核表达与免疫学特性研究被引量：3: 2013年; 目的:探究2型猪链球菌(S.suis2)强毒株05ZYH33的srtF基因簇编码的菌毛结构亚蛋白SSU0473的细菌定位及其免疫保护效能。方法:原核表达截短的SSU0473(tSSU0473),并以亲和层析法纯化目的蛋白,Western印迹检测tSSU0473蛋白的免疫原性,ELISA法检测多抗血清的效价及IgG亚型,小鼠试验测试重组蛋白的免疫保护效能,免疫电镜观测tSSU0473蛋白的细菌定位。结果:在原核系统中表达了tSSU0473蛋白;ELISA结果显示重组蛋白能够刺激小鼠产生高效价的免疫抗体;动物试验表明tSSU0473蛋白免疫小鼠可抵御致死剂量病原体的攻击,显示出较好的免疫保护作用;免疫电镜检测显示tSSU0473蛋白定位于细菌表面。结论:菌毛亚蛋白tSSU0473是S.suis2膜表面蛋白,具有良好的免疫原性和免疫保护性,可作为S.suis2亚单位疫苗的候选分子。研究结果为系统揭示S.suis2的菌毛生物学结构与功能奠定了基础。; 胡丹张先云耿美玲张凤玉郝丽娜朱静郑峰潘秀珍王长军; 关键词：2型猪链球菌菌毛原核表达免疫保护

荚膜唾液酸对猪链球菌激活巨噬细胞TLR2-AKT-NF-κB信号通路影响的研究被引量：4: 2013年; 【目的】探索猪链球菌2型感染后单核/巨噬细胞启动信号转导通路机制,探讨荚膜唾液酸对细菌激活巨噬细胞TLR2-AKT-NF-κB信号通路的影响。【方法】以小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞为研究对象,采用RT-PCR、Western blotting、免疫荧光和ELISA法分别检测猪链球菌2型野毒株、唾液酸缺失突变株、唾液酸回复突变株感染后不同时间点巨噬细胞TLR2 mRNA转录水平、AKT磷酸化水平、NF-κB激活程度以及前炎症因子TNF-α分泌水平;再分别用TLR2阻断剂和PI-3K抑制剂预处理巨噬细胞,检测上述分子的表达水平。【结果】唾液酸缺失株可选择性的活化信号转导通路途径。RT-PCR结果表明,缺失株TLR2 mRNA表达水平自1 h开始升高,1.5 h达高峰后有所下降;Westernblotting显示,缺失株TLR2蛋白表达水平7 h达高峰,9 h下降;p-AKT水平1.5 5 h持续稳定在高峰水平,7 h后开始下降;免疫荧光可见15 min NF-κB激活-核转运程度较高;ELISA结果显示,10 h之后TNF-α的水平显著高于野生株和回复株。使用TLR2阻断剂和PI-3K抑制剂,三菌株通路活化程度均明显受抑制。【结论】荚膜唾液酸可抑制宿主免疫细胞TLR2-AKT-NF-κB信号通路的激活,藉此参与细菌逃避宿主的免疫防御作用。; 朱静胡丹刘丽娜张锦海张凤玉郝丽娜耿美玲郑峰朱进潘秀珍王长军; 关键词：猪链球菌2型巨噬细胞信号通路

建立染料法荧光定量PCR检测恙虫病东方体被引量：2: 2014年; 目的建立染料法荧光定量PCR检测恙虫病东方体。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计特异性引物，建立染料法（SYBRgreenI）实时荧光定量PCR，评估其灵敏性及特异性；并对恙虫病东方体鸡胚培养物、东方体感染小白鼠脏器标本以及恙虫病病人血样等多种样本进行检测。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r2=0．99），灵敏性评估显示20¨l体系单PCR反应管靶基因大于28个拷贝即可被有效检测，最低检出浓度为2拷贝／¨l，比普通PCR检测方法提高1～2个数量级，并且具有较好的重复性；建立的SYBRI染料法具有良好的特异性，与立氏立克次体R株等其他5种立克次体，以及被检测的其他几种病原菌DNA模板均不发生特异性扩增；用建立的染料法对东方体鸡胚培养物、东方体感染动物脏器，以及采集的现场恙虫病病人血样共59份标本进行检测，其中57份检出阳性。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肾脏、肝脏标本，结果脾脏中东方体检出量最多，肝脏和肾脏次之，血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立荧光定量PCR方法均具有很高的特异性和敏感性，适合各种样本中东方体的快速检测，可用于实验室的快速诊断。; 耿美玲操敏张锦海胡丹郝丽娜张凤玉龚秀芳李丙军潘秀珍王长军; 关键词：恙虫病荧光定量PCR法

合肥首例恙虫病病人血中东方体56kDa外膜蛋白部分基因的扩增及进化分析被引量：5: 2013年; 采用恙虫病胶体金快速诊断试剂对安徽省合肥市一例不明原因发热病人血清进行检测，从该病人血块中提取DNA为模板，用恙虫病东方体特异性引物，PCR扩增出56kDa外膜蛋白部分基因，将扩增目的片段克隆至T载体进行测序并进行基因进化分析。结果显示，该病人血清中抗恙虫病东方体总抗体、抗东方体IgG及抗东方体IgM阳性；患者给予强力霉素治疗后迅速退热。采用PCR从病人血标本中扩增出1320bp东方体56kDa外膜蛋白基因片段，将基因片段测序结果在NCBI上做BLAST比对，显示该基因序列与昆明株和内蒙古株同源基因序列完全一致；进化树分析显示该序列与标准株Kuroki位于同一个分支。研究确认该发热病例为合肥市报告的首例恙虫病，其感染的恙虫病东方体为Kuroki型，推测合肥市可能为恙虫病新疫区。; 操敏耿美玲陈乐如毛应华谭伟龙王长军朱进王忠灿; 关键词：恙虫病东方体进化树

恙虫病东方体快速检测方法的建立和评估: 恙虫病（scrub typhus）是由恙虫病东方体（orientia tsutusgamushi）通过恙螨幼虫叮咬而传播的一种自然疫源性疾病。据调查,在亚太地区,大约10亿人群有潜在感染风险,每年约100万新病例出现。由...; 耿美玲; 关键词：恙虫病胶体金免疫层析法; 文献传递

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