万青
- 作品数：4 被引量：4H指数：1
- 供职机构：东南大学医学院理学与病理生理学系更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 癌蛋白TRE17泛素化位点的初步鉴定
- 2016年
- 目的研究癌蛋白TRE17单泛素化的位点,为深入探讨其单泛素化的机制及鉴定其泛素连接酶E3提供研究基础。方法使用截短体逐步逼近的方法构建了一系列TRE17变异体,包括HA-TRE17(375)和HA-TRE17(303);用重叠延伸PCR方法构建了TRE17的中间缺失变异体HA-TRE17(447,Δ340-361)。随后,变异体质粒被分别转染HEK 293细胞,用Western blot方法鉴定各变异体及其单泛素化条带在HEK 293细胞内的表达。结果 HA-TRE17(447)、HA-TRE17(375)有单泛素化蛋白条带,而HA-TRE17(303)无单泛素化蛋白条带;与HA-TRE17(303)变异体一样,HA-TRE17(447,Δ340-361)也无单泛素化蛋白条带。结论 TRE17单泛素化位点可能位于340-361之间或附近的氨基酸残基。
- 张永臣赵虎子赵蕾张丽娜王北万青沈传陆
- 关键词：癌蛋白泛素
- 人肌球蛋白调节性轻链的原核表达及纯化被引量：1
- 2013年
- 目的:构建pGEX-MLC2重组质粒,在大肠杆菌中表达并纯化谷胱甘肽硫转移酶(GST)-MLC2融合蛋白,以用于MLC2抗体的制备。方法:从人乳腺癌MCF-7细胞中提取总RNA,通过RT-PCR获得人MLC2cDNA全长开放读码框架(open reading frame,ORF),并将其重组于原核蛋白表达质粒pGEX-6P-1中,经限制性内切酶和DNA测序鉴定,将该重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21,用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-MIC2融合蛋白后,进行Western blotting分析,鉴定GST-MLC2蛋白;通过GlutathioneSepharose 4B亲和层析柱纯化融合蛋白,并用SDS-PAGE电泳鉴定该融合蛋白的纯度。结果:人乳腺癌MCF-7细胞MLC2的RT-PCR产物为535 bp,符合预期;重组质粒pGEX-MLC2经BamHI和EcoRI双酶切出现特征性的525 bp片段;DNA测序证实MLC2全长ORF序列正确无误。IPTG诱导表达的GST-MLC2融合蛋白分子质量约为46.6 kDa,纯化后其蛋白纯度约95%,经Western blotting分析表明诱导表达的蛋白是GST-MLC2融合蛋白。结论:人MLC2蛋白原核表达质粒的构建、GST-MLC2融合蛋白的表达和纯化,为MLC2抗体的制备及MLC2功能的深入研究奠定了基础。
- 陈洋何泽张永臣万青赵虎子赵蕾沈传陆
- 关键词：原核表达GST融合蛋白蛋白纯化
- TC-1癌蛋白高表达促进人BT549乳腺癌细胞迁移被引量：3
- 2016年
- 目的:构建甲状腺癌基因-1(TC-1)真核表达质粒,观察TC-1癌蛋白高表达对人乳腺癌细胞迁移的影响。方法:用蛋白质印迹方法检测TC-1癌蛋白在培养的人MCF-7和BT549乳腺癌细胞中表达;从MCF-7细胞中提取总RNA,通过实时PCR(RT-PCR)扩增人TC-1 c DNA全长开放读码框架(ORF),并插入真核表达载体Flag-pc DNA3.0中构建Flag-TC-1-pc DNA3.0重组质粒;经限制性内切酶和DNA测序鉴定后,该重组质粒用于转染BT549细胞,进行蛋白质印迹分析鉴定Flag-TC-1融合蛋白表达;进行细胞划痕实验,观察TC-1对BT549细胞迁移的影响。结果:TC-1蛋白在人MCF-7乳腺癌细胞中显著表达,而BT549细胞中表达极低;人MCF-7乳腺癌细胞TC-1全长ORF的RT-PCR产物为337 bp;重组质粒Flag-TC-1-pc DNA3.0经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切出现特征性的327 bp片段;DNA测序证实TC-1全长ORF序列正确无误,以正确的阅读框架插入Flag-pc DNA3.0载体中。蛋白质印迹结果显示该重组质粒转染的BT549细胞表达的FlagTC-1融合蛋白可被抗Flag抗体特异性识别,分子质量约为13.6 k Da,符合预期;划痕实验结果显示,高表达TC-1的BT549细胞迁移性增加。结论:内源性TC-1蛋白在人BT549乳腺癌细胞中表达极低,Flag-TC-1融合蛋白高表达促进BT549细胞迁移。
- 张丽娜赵虎子张永臣赵蕾王北万青沈传陆
- 关键词：乳腺癌细胞真核表达迁移
- 癌蛋白PRC17与人肌球蛋白调节轻链相互作用的初步鉴定
- 2014年
- 目的:分析前列腺癌基因17(PRC17)与人肌球蛋白调节轻链(MLC2)之间的相互作用,并鉴定PRC17蛋白序列上与MLC2相互作用的功能区域。方法:经大肠杆菌表达并用Glutathione Sepharose 4B纯化GST及融合蛋白GST-MLC2,用SMMC-7721细胞表达带HA标签的PRC17及其截短突变体HA-PRC17(353)、HA-PRC17(251)、HA-PRC17(164)和HA-PRC17(Δ164),GST沉淀实验分析GST-MLC2与PRC17及其截短体的相互作用。结果:经诱导表达并纯化的GST和GST-MLC2分子质量符合预期,分别约为28.4 kD和46.6 kD,纯度均95%以上;GST沉淀实验结果显示,PRC17结合MLC2,不结合阴性对照GST;PRC17(353)和PRC17(251)也能有效结合MLC2,但PRC17(164)和PRC17(Δ164)都不能与MLC2结合。结论:PRC17能特异性结合MLC2,其蛋白序列上与MLC2结合的部位位于其氨基端251位氨基酸之内,可能在164位氨基酸附近。
- 何泽陈洋张永臣万青赵虎子赵蕾沈传陆
- 关键词：肌球蛋白轻链融合蛋白相互作用
