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HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合DNA诱导BALB/c小鼠产生特异性细胞免疫的研究: 2010年; 目的探讨人乳头瘤病毒（HPV）6b结构蛋白L1和沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）多表位嵌合DNA（HPV6b L1/Ct MOMP）诱导BALB/c小鼠产生特异性细胞免疫效应,及HPV6b L1对Ct MOMP多表位基因诱导细胞免疫的增强作用.方法将Ct MOMP多表位基因连接在经真核密码子优化的HPV6b L1羧基端,构建嵌合重组质粒pcDNA3.1（＋）/HPV6b L1/Ct MOMP多表位,经酶切和测序证实后,转染COS-7细胞,间接免疫荧光鉴定其在真核细胞中的表达;将纯化后的嵌合重组质粒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,并设置pcDNA3.1（＋）/Ct MOMP多表位质粒、pcD-NA3.1（＋）和PBS三组对照.采用0、2、4周免疫程序,DNA剂量为每只150μg/次.于末次免疫后2周,分别用乳酸脱氢酶（LDH）释放法和细胞内细胞因子染色-流式细胞术（ICS-FAGS）检测小鼠脾细胞对Ct MOMP多表位蛋白和HPV6b L1蛋白的特异性CTL活性,胞内细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10产生水平等细胞免疫应答指标.结果免疫后,在效靶比（E∶T）分别为40∶1、20∶1时,pcDNA3.1（＋）/HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合重组质粒免疫组小鼠产生了针对Ct MOMP多表位蛋白特异性CTL杀伤活性（44.56%±4.02%,35.35%±2.89%）和HPV6b L1蛋白特异性CTL杀伤活性（27.08%±2.04%,21.68%±4.06%）,与各对照组比较差异有统计学意义（F=72.87,F=114.55,P＜0.05;F=30.04,F=10.47,P＜0.05）,且显著高于pcDNA3.1（＋）/Ct MOMP多表位质粒组（35.50%±2.68%,30.24%±1.75%;12.27%±3.36%,9.32%±3.07%;P＜0.05）;而pcDNA3.1（＋）/Ct MOMP多表位质粒组小鼠仅显示了Ct MOMP多表位特异性的CTL杀伤活性,与对照组比较差异也有统计学意义（F=58.85,F=120.21;P＜0.05）.胞内细胞因子IFN-γ的产生水平,pcDNA3.1（＋）/HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合质粒组（4.34%±0.06%）高于pcDNA3.1（＋）/Ct MOMP多表位质粒组（3.14%±0.18%）,与对照组比较差异有统计学意义（F=473.83,P＜0.05）,而重组质粒组较空载体组和PBS对; 石朝辉朱珊丽许文陆丽君李玲玲张丽芳; 关键词：主要外膜蛋白细胞毒T细胞

HPV18 E7基因的原核表达及其在宫颈癌患者血清抗体中的检测被引量：1: 2010年; 目的研究人类乳头瘤病毒18型E7全长基因(HPV18 E7)在原核表达系统中的表达,及其作为特异性抗原在宫颈癌血清抗体检测中的意义,为HPV感染与肿瘤相关的血清学诊断研究奠定基础。方法PCR法扩增HPV18 E7全长基因,构建重组质粒pET32a(+)/HPV18 E7,转化表达HPV18 E7融合蛋白后经纯化、SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。再以该融合蛋白作为诊断抗原,间接ELISA法检测宫颈癌、尖锐湿疣及健康对照三组血清特异性IgG抗体水平。结果HPV18 E7融合蛋白表达量约占菌体总蛋白的35.00%;宫颈癌、尖锐湿疣及健康对照组的血清特异性抗体均值分别为0.604±0.328,0.287±0.202和0.342±0.225,三组间差异有显著性意义(F=32.771,P<0.01);宫颈癌组与尖锐湿疣组及健康对照组的HPV18E7均值比较,差异均有显著性意义(P均<0.01),而尖锐湿疣组与健康对照组抗体均值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论HPV18 E7融合蛋白具较强的抗原性,对宫颈癌诊断试剂的研究具有应用价值。; 吴永琴陈军朱珊丽孟锐锋陆丽君张丽芳; 关键词：HPV18 宫颈癌 ELISA 血清特异性抗体

沙眼衣原体热休克蛋白60的B细胞表位预测及分析被引量：2: 2010年; 目的:分析沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)热休克蛋白60(heat shock protein 60,HSP60)的二级结构并预测其B细胞优势表位,进一步分析其在沙眼衣原体相关自身免疫性疾病发病中的意义。方法:以CT标准株(E/UW-5/Cx)HSP60的完整氨基酸序列为基础,分别采用SOPMA、GOR、nnPredict和HNN四种方法预测CHSP60的二级结构,并结合其跨膜区域、亲水性、表面可及性、抗原性、极性和柔韧性等参数进行综合分析,预测CHSP60可能的B细胞优势表位,并将B细胞优势表位与人HSP60的氨基酸序列进行比对,分析两者之间的同源性,寻找可能与自身免疫性疾病相关的B细胞表位。结果:四种方法对CHSP60二级结构的预测表明,其二级结构中柔性区域以无规卷曲为主,少见转角。其B细胞优势表位可能位于氨基酸79～85、135～140、433～440和526～532区域,而上述序列与人HSP60氨基酸序列比对后,发现其135～140、433～440和526～532区域与人HSP60氨基酸159～164,457～464、549～556区域有较高的同源性。结论:CHSP60可能的B细胞优势表位中,135～140、433～440和526～532区域可能与CT感染相关自身免疫性疾病的发病有关。; 王作鹏林文军金晓兰陆丽君朱珊丽张丽芳; 关键词：沙眼衣原体热休克蛋白60 B细胞表位

EB病毒潜伏膜蛋白2多表位的原核表达及其抗原特性分析被引量：1: 2010年; 目的对EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白2（LMP2）中富含T、B细胞多表位肽段基因进行原核表达,并分析该多表位蛋白的抗原特性.方法利用计算机在线软件预测EBV LMP2蛋白的CTL表位、Th表位.选取富含CTL表位和Th表位的肽段,兼顾其上下游已预测的B细胞表位,组成含多个T、B细胞表位的EBV LMP2多表位,该多表位基因序列经原核密码子优化后全序列合成,并克隆入原核表达载体pET32a（＋）得到pET32a（＋）/EBV-LMP2多表位重组质粒,经IPTG诱导在E.coli BL21（DE3）表达并纯化,经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定;采用EBV膜蛋白家兔免疫血清和鼻咽癌患者血清进行Western blot分析其抗原特性;并利用EBV-LMP2多表位蛋白免疫BALB/c小鼠,分别采用LDH和ELISA方法检测小鼠脾细胞特异性CTL杀伤效应及血清特异性抗体IgG水平,以分析该表位蛋白的免疫原性.结果 LMP2（aa195-232）和LMP2（aa419-436）肽段富含CTL、Th和B细胞表位,将其串联后作为EBV LMP2多表位,该多表位基因在大肠杆菌中获得了表达.表达产物的相对分子质量（Mr）约27×103,与预期Mr相符;经Western blot证实EBV-LMP2多表位具有抗原特异性,可被EBV膜蛋白家兔免疫血清和鼻咽癌患者血清特异性抗体识别;小鼠免疫结果显示EBVLMP2多表位可诱导机体产生特异性的CTL杀伤效应,随着效靶比（1：5,1：10,1：25）增加,CTL杀伤活性逐渐增强（12.52%±2.59%,21.80%±1.08%,23.68%±3.74%）,同时产生了特异性血清IgG抗体反应（A490=0.258±0.040）,与对照组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）.结论本研究设计的EBV-LMP2多表位具有良好的抗原性和一定的免疫原性.; 陆丽君李玲玲刘建晓王佳朱珊丽陈筱菲张丽芳; 关键词：EB病毒潜伏膜蛋白表位

HPV6L1/CtMOMP多表位融合基因在COS-7细胞的表达及其在小鼠的免疫效果观察被引量：2: 2010年; 研究人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)6b结构蛋白L1(HPV6b L1)基因佐剂增强沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)主要外膜蛋白(MOMP)多表位(Ct MOMP168)DNA疫苗的免疫效果的可能性.构建pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP168融合重组质粒,转染COS-7细胞,用RT-PCR、激光共聚焦显微技术及Western印迹技术检测其表达.分别用pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP168、pcDNA3.1(+)/Ct MOMP168及pcDNA3.1(+)质粒肌肉免疫BALB/c小鼠,ELISA检测外周血中IgG及阴道分泌物中sIgA.结果表明,pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/CtMOMP168可在COS-7细胞中表达;Ct MOMP168组和HPV6b L1/Ct MOMP168组均可刺激小鼠产生抗Ct MOMP特异性的抗体,抗体滴度随免疫次数增加而升高,且HPV6b L1/Ct MOMP168组小鼠产生的抗体滴度明显高于Ct MOMP168组(P<0.05).结果提示,分子佐剂HPV6b L1与CtMOMP多表位基因融合能够显著增强Ct MOMP多表位DNA疫苗的体液免疫应答.; 许文石朝辉朱珊丽陆丽君孟锐峰李玲张丽芳; 关键词：人乳头瘤病毒沙眼衣原体主要外膜蛋白 DNA疫苗

EB病毒膜蛋白家兔免疫血清的制备及其特性研究被引量：5: 2009年; 目的:制备高效价EB病毒膜蛋白抗体,并对其效价及其与EBV结合的特异性进行鉴定。方法:将B95-8细胞培养至3×105/mL时,超声破碎,纯化获得EB病毒膜蛋白抗原;EB病毒膜蛋白抗原经弗氏佐剂乳化,在家兔背部皮下多点免疫注射,间隔2周免疫,共3次,并分别于免疫前和每次免疫后1周取兔血清,检测兔免疫血清抗体IgG;进一步采用Western blot检测制备的血清抗体与EBV结合的特异性,同时采用ELISA法检测兔血清抗体水平及各周抗体滴度的变化趋势。结果:所有家兔在全程免疫后都产生了高效价膜蛋白的特异性抗体,最高滴度达1:6400。结论:用B95-8细胞制备的EB病毒膜蛋白抗原免疫家兔,可成功制备高效价的特异性血清抗体,为EB病毒膜蛋白抗原的免疫学检测奠定了基础。; 陆丽君孟锐锋国强朱珊丽张丽芳; 关键词：EBV 免疫性

密码子优化的HPV6b L1 DNA诱导BALB／c小鼠产生增强的免疫应答: 2009年; 目的探讨真核细胞偏好密码子优化对人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）6b型L1 DNA诱导BALB／c小鼠特异性体液和细胞免疫应答的增强效应。方法利用PCR从尖锐湿疣组织中扩增HPV6b L1基因，将其克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（＋），构建野生型pcDNA3．1（＋）／HPV6bLl（wt）并进行鉴定；同时，对HPV6b L1基因进行真核细胞偏好密码子优化，进一步通过重叠PCR的方法获得全长基因，构建密码子优化的重组质粒pcDNA3．1（＋）／HPV6bLl（rood．）并进行鉴定。将6～8周龄雌性BALB／c小鼠分成4组，分别肌肉注射3次pcDNA3．1（＋）／HPV6bLI（mod．）、pcDNA3．1（＋）／HPV6bL1（wt）、pcDNA3．1（＋）载体和PBS，间隔2周，每次剂量为150μg／鼠。分别于免疫前和免疫后每隔2周，收集血清，用间接ELISA检测血清IgG抗体；并于第8周取小鼠脾细胞，采用乳酸脱氢酶释放法，按效应细胞与靶细胞之比（E：T）为5：1、10：1、20：1进行免疫小鼠特异性CTL杀伤活性检测。结果成功构建了密码子优化的HPV6b L1重组质粒。小鼠免疫后血清特异性IgG抗体水平随着免疫时间和次数的增加而升高。pcDNA3．1（＋）／HPV6bLl（mod．）组血清IgG抗体在第8周达到高峰，与pcDNA3．1（＋）／HPV6bLl（wt）、载体和PBS对照组相比差异均有统计学意义（t=18．138、t=29．140、t=30．840，P值均〈0．01）；而pcDNA3．1（＋）／HPV6bLl（wt）组与载体和PBS组比较差异也有统计学意义（t=20．072、t=22，457，P值均〈0．01）。在特异性CTL杀伤实验中，当E：T分别为5：1、10：1、20：1时，pcDNA3．1（＋）／HPV6bLI（mod．）组的脾细胞特异性CTL杀伤率明显高于pcDNA3．1（＋）／HPV6bLl（wt）组（t=11．892、t=15．329、t=2．911，P值均〈0．05）、载体组（t=12．936、t=16．613、t=13．901，P值均〈0．01）和PBS对照组（t=14．768、t=18．935、t：10．925，P; 陆丽君石朝辉孟锐锋朱珊丽肖敏张丽芳; 关键词：密码子抗体生成

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