杨明花
- 作品数：6 被引量：1H指数：1
- 供职机构：中国医科大学附属第一医院更多>>
- 发文基金：辽宁省科学技术计划项目辽宁省医学高峰建设工程项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 树突状细胞感染PSMA/4-1BBL基因重组腺病毒后的免疫功能变化被引量：1
- 2012年
- 目的:观察复制缺陷型腺病毒介导的人前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)基因和肿瘤坏死因子配体超家族成员4-1BB配体(4-1BB ligand,4-1BBL)基因体外共同感染的树突状细胞(dendritic cell,DC)的免疫学功能变化。方法:Ad-GFP空载体感染未成熟DC,确定最适MOI。将感染的健康志愿者外周血来源DC分为Ad-PSMA/4-1BBL-DC组(共感染组)、Ad-PSMA-DC组、Ad-4-1BBL-DC组、Ad-GFP-DC组以及未感染DC组,荧光倒置显微镜观察DC的形态学变化,流式细胞仪分析CD80、CD83、CD86等表型变化,Western blotting检测DC上PSMA和4-1BBL蛋白的表达,ELISA法检测各组DC上清的IL-12水平,CCK-8法检测各组DC刺激自体T淋巴细胞增殖能力及对人前列腺癌细胞株LNCap、Du145和22RV的细胞毒作用。结果:确定最佳MOI为200。共感染组DC表面CD80、CD83、CD86、HLA-DR共刺激分子均上调,明显高于未感染DC组[(38.72±0.99)%、(44.65±0.77)%、(63.60±0.75)%、(62.25±0.58)%vs(28.27±1.04)%、(28.08±1.16)%、(41.05±1.33)%、(46.87±1.12)%;P<0.05]。共感染组IL-12分泌水平明显高于单个基因重组腺病毒感染组及未感染组[(134.29±2.22)vs(79.51±1.60)、(70.33±1.13)、(69.67±1.43)、(28.88±2.97)pg;P<0.05]。DC∶T同一比例下,共感染组刺激自体T细胞增殖能力明显高于单感染组及未感染组(P<0.05)。PSMA/4-1BBL-DC-CTL对PSMA阳性的LNCap细胞的杀伤率明显高于对另两种PSMA阴性细胞DU145、22RV的杀伤率(P<0.05),也明显高于PSMA-DC-CTL组、4-1BBL-DC-CTL组的杀伤率(P<0.05)。结论:Ad-PSMA/4-1BBL感染后,DC不但高分泌IL-12,还能刺激和增强肿瘤特异性CTL对PSMA阳性前列腺癌细胞的杀伤作用;Ad-PSMA和Ad-4-1BBL共感染DC较单一感染DC能更有效诱导肿瘤特异性CTL。
- 杨明花王帅孙海燕刘晓辉马楠隋承光
- 关键词：4-1BBL基因细胞毒性T淋巴细胞
- 人PSMA基因重组腺病毒的构建及其在树突状细胞上的表达
- 2012年
- 目的:构建含有人前列腺特异性膜抗原基因(prostate specific membrane antigen,PSMA)的重组腺病毒,并将其感染树突状细胞(dendritic cell,DC)后检测其在DC上的表达。方法:设计一对含有Sfi I酶切位点的PSMA基因上下游引物,以质粒pCMV-SPORT6/PSMA为模板,通过PCR扩增获得PSMA基因序列。片段回收、酶切处理,连接到穿梭质粒pShuttle-CMV-EGFP上,获得重组穿梭质粒pShuttle-EGFP-PSMA经Sfi I酶切、PCR及插入片段测序鉴定正确后,将其用I-CeuI和I-SceI双酶切处理,转移至pAdxsi载体上,得到pAdxsi-GFP-PSMA病毒质粒,线性化后经HEK293细胞包装成复制缺陷型腺病毒Ad-PS-MA-GFP;感染从健康志愿者外周血来源的DC,荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western blot检测PSMA基因在DC上的表达。结果:成功构建含有人PSMA基因的重组腺病毒,病毒滴度为2×10^(10)pfu/mL构建好的Ad-PSMA-GFP可以在DC上高效和正确地表达结论:人PSMA重组腺病毒载体的成功构建及其在DC上的表达,为下一步研究奠定了基础。
- 王帅杨明花隋承光
- 关键词：腺病毒树突状细胞DC疫苗
- ATC-IC致敏的树突状细胞诱导T淋巴细胞抗肿瘤效应的研究
- 2012年
- 目的探讨凋亡的肾癌细胞与G250单克隆抗体(mAb)形成的复合物(ATC-IC)致敏树突状细胞(DC)后,DC对T淋巴细胞的激活、增殖作用及对肾透明细胞癌细胞的抑癌效应。方法制备凋亡的肾癌细胞与G250 mAb形成的复合物ATC-IC;分离健康供血者外周血单个核细胞及T淋巴细胞,联合应用粒—巨细胞集落刺激因子及白细胞介素从单个核细胞中培养出DC,以制备的ATC-IC刺激DC为实验组,以凋亡的肾癌细胞刺激DC和未经任何因素刺激的DC为对照组,检测各组DC对T淋巴细胞的细胞增殖动力学的影响,并用CCK-8测定诱导的细胞毒性T淋巴细胞对肾癌细胞株786-0和肺癌细胞株A549的杀伤活性。结果 ATC-IC致敏的DC诱导T淋巴细胞强烈的增殖反应,与对照组比较具有统计学差异(P<0.01);增殖后的T淋巴细胞对786-0的杀伤率明显高于对照组(P<0.05),而2组对A549细胞均无明显杀伤活性。结论经ATC-IC致敏的DC能诱导T淋巴细胞增殖,在体外可有效的诱导特异性抗肾癌效应。
- 孙海燕刘晓辉杨明花马楠刘云鹏姜又红
- 关键词：树突状细胞T淋巴细胞
- 人4-1BBL基因重组腺病毒载体的构建及其在HEK293细胞的表达
- 2011年
- 目的体外构建含有人4-1BBL基因的重组腺病毒载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法设计一对含有SfiI酶切位点的4-1BBL基因上下游引物,以质粒pCR4-TOPO-4-1BBL为模板,通过PCR扩增获得4-1BBL基因全序列。片段回收后经酶切处理,连接到穿梭质粒pShuttle-CMV-EGFP上,获得重组穿梭质粒pShuttle-EGFP-4-1BBL。经SfiI酶切、PCR及插入片段测序鉴定正确后,将其用I-CeuI和I-SceI双酶切处理,转移到pAdxsi载体上,得到pAdxsi-GFP-4-1BBL病毒质粒,PCR鉴定正确后,经HEK293细胞包装成复制缺陷型腺病毒Ad-4-1BBL,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western blot检测目的基因人4-1BBL的表达。结果酶切鉴定和序列分析证实,重组腺病毒质粒含有人4-1BBL全长cDNA编码序列,病毒滴度为1.2×1010pfu/mL。转染HEK293细胞后荧光显微镜下观察到GFP的表达,Western blot检测可见4-1BBL蛋白的正确表达。结论人4-1BBL基因重组腺病毒载体的成功构建和在HEK293细胞中的表达,为下一步将其应用于前列腺癌的免疫治疗奠定了基础。
- 杨明花王帅田昕王扬隋承光
- 关键词：4-1BBL腺病毒共刺激分子
- 人前列腺特异性膜抗原基因重组腺病毒的构建及其表达
- 2011年
- 目的体外构建含有人前列腺特异性膜抗原(PSMA)基因的重组腺病毒载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法设计一对含有SfiI酶切位点的PSMA基因上下游引物,以质粒pCMV-SPORT6/PSMA为模板,通过PCR扩增获得PSMA基因全序列。片段回收后经酶切处理,连接到穿梭质粒pShuttle-CMV-EGFP上,获得重组穿梭质粒pShuttle-EGFP-PSMA。经SfiI酶切、PCR及插入片段测序鉴定正确后,将其用I-CeuI和I-SceI双酶切处理,转移到pAdxsi载体上,得到pAdxsi-GFP-PSMA病毒质粒,线性化后经HEK293细胞包装成复制缺陷型腺病毒Ad-PSMA,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,RT-PCR,Western印迹检测目的基因人PSMA的表达。结果成功构建了含有人PSMA基因的重组腺病毒,病毒滴度为2×1010 pfu/ml。Western印迹检测可见PSMA蛋白的正确表达。结论该重组腺病毒载体的成功构建及表达,为下一步以人PSMA作为靶抗原构建DC疫苗和基因免疫治疗奠定基础。
- 杨明花王帅田昕李妍隋承光
- 关键词：腺病毒基因表达
- PSMA/4-1BBL共转染DC疫苗联合CIK细胞体外抑制前列腺癌的实验研究
- 2013年
- 目的:本研究通过复制缺陷性腺病毒介导的人前列腺特异性膜抗原基因(PSMA)和肿瘤坏死因子配体超家族成员(4-1BBL)体外共同转染树突状细胞(DC)后,与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养,观察其体外抑制前列腺癌的生物学效应。方法:将Ad-PSMA、Ad-4-1BBL、Ad-GFP按MOI=200∶1转染DC作为刺激细胞,分为共转染组、PSMA转染组、4-1BBL转染组、阴性对照组(Ad-GFP-DC组)以及未转染DC组,Western blot法检测各组DC细胞中PSMA和4-1BBL蛋白的表达;流式细胞仪分析CD80、CD83、CD86等表型变化;取患者外周静脉血单个核细胞中淋巴细胞用于CIK细胞的诱导培养,按DC∶CIK=1∶10比例将上述不同转染组DC加入CIK中,共同孵育96h(设普通DC刺激组和单独CIK细胞组为对照),收获的细胞作为效应细胞,流式细胞仪测定不同DC刺激组CIK细胞CD3、CD56表达率,ELISA法检测不同DC-CIK组培养上清IFN-γ、IL-10水平;PE-7AAD凋亡试剂盒检测不同DC-CIK组对人前列腺癌细胞株LNCap、Du145的细胞毒作用。结果:Western blot结果证实PSMA、4-1BBL可在DC上成功表达;各转染组DC表面CD80、CD83、CD86、HLA-DR共刺激分子表达上调,与未转染组相比较差异显著(P<0.05)。培养14d,不同DC疫苗刺激组CIK以及单独CIK细胞组中CD3+、CD56+、CD3+/CD56+T细胞比例均高于培养7d的CIK,差异显著(P<0.05),其中经不同DC疫苗刺激的CIK组上升较单独培养14d-CIK组更明显(P<0.05)。DC-CIK培养上清中PSMA/4-1BBL-DC-CIK组IFN-γ分泌量最高,达1176.10±14.37pg/5×106cells,IL-10分泌量最低,为75.14±2.01 pg/5×106cells,与其他各组比较,差异显著(P<0.05)。不同组别DCCIK作用于LNCap、Du145细胞24h后,荧光显微镜下观察细胞凋亡和坏死明显。同一组别DC疫苗刺激下的CIK细胞对LNCap的杀伤作用强于DU145细胞,差异显著(P<0.05)。而在针对同一种肿瘤细胞时,PSMA/4-1BBL-DC-CIK组的杀伤作用最强,LNCap细胞的凋亡率可达(24.56±1.68)%,Du145细胞凋
- 隋承光杨明花孟繁东王帅孙海燕刘晓辉王扬
- 关键词：4-1BBL基因
