李盼
- 作品数：6 被引量：3H指数：1
- 供职机构：军事医学科学院基础医学研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 萤光素酶表达质粒pEE14.1-luc的构建及表达
- 2014年
- 目的:为研究10 kb以上DNA疫苗质粒的体内电穿孔递送,构建萤光素酶报告基因表达质粒p EE14.1-luc,并验证其表达。方法:从质粒p GL3-CMV中通过酶切、补平和纯化的方法获得萤光素酶基因luc,克隆入p EE14.1载体,构建重组表达质粒p EE14.1-luc,瞬时转染293T细胞,采用Western印迹、流式细胞术和免疫荧光等方法对萤光素酶基因在体外的表达情况进行验证,并运用活体成像仪检测萤光素酶基因在小鼠活体内的表达。结果:经菌液PCR鉴定和测序验证,p EE14.1-luc与预期设计完全一致;流式细胞术检测luc阳性表达率为22.41%,免疫荧光检测可见绿色荧光表达,Western印迹检测在相对分子质量为62×103处显现目的蛋白条带;同时,利用活体成像技术也检测到萤光素酶基因在小鼠活体内的表达。结论:p EE14.1-luc表达质粒构建成功,为研究DNA疫苗体内表达机制和体内电穿孔递送条件优化奠定了基础。
- 朱晓明李盼王琳王宇张亮徐元基杜芝燕于继云阎瑾琦
- 关键词：萤光素酶活体成像
- 乙肝可复制型DNA疫苗低电压电穿孔递送与免疫活性研究
- DNA疫苗在治疗性疫苗研究领域的地位至关重要。关于DNA疫苗体内递送的研究发展很快，从最初的直接注射到基因枪接种，再发展到新近出现的电穿孔技术，质粒DNA的体内递送效率显著提高，这为DNA疫苗快速发展和应用提供了有力的技...
- 李盼
- 关键词：荧光素酶基因细胞免疫体液免疫
- 文献传递
- 响应面法优化工程菌E.coli HBVA发酵培养基被引量：2
- 2013年
- 目的:对携带乙型肝炎DNA疫苗质粒pSVK-HBVA的工程菌发酵培养基进行优化。方法:采用单因素法比较不同碳源、氮源以及无机盐对发酵产量的影响;利用响应面法对各因素最佳水平及交互作用进行进一步研究。结果:单次单因子法优化结果显示,LB为最适基础培养基,最佳碳源和氮源分别是甘油和国产的眎蛋白胨;PB实验结果表明,影响质粒产量的3个主要影响因子为眎蛋白胨、甘油、NH4Cl,经过最陡爬坡和CCD优化后的发酵培养基,质粒的容积产率达到13.61 mg/L,是基础培养基LB发酵产量的2倍以上。结论:优化了工程菌E.coli HBVA的发酵培养基,提高了质粒pSVK-HBVA的产量。
- 王宇吴昊朱晓明张亮徐元基张巍杜芝燕肖毅王琳王琳李盼侯沙沙于继云
- 关键词：DNA疫苗发酵培养基优化响应面
- 人G250真核表达载体pIRES-neo-G250的构建及表达
- 2013年
- 目的构建包含人的G250真核表达载体,并将该载体转导入293 T细胞检测其表达,为构建以G250为靶点的肾癌模型提供研究基础。方法通过聚合酶链反应获得G250基因,将其连接至PMD18T过渡载体,然后克隆到载体pIRES-neo中。把构建后的重组质粒pIRES-neo-G250转染到293 T细胞,用流式细胞仪、免疫荧光和RT-PCR检测其表达。结果 PCR扩增出的G250基因测序正确,酶切鉴定重组质粒pIRES-neo-G250正确,说明质粒构建成功;流式细胞术、免疫荧光和RT-PCT检测结果表明,重组质粒pIRES-neo-G250在293 T细胞中得到表达。结论该实验成功构建了重组质粒pIRES-neo-G250,并且在293T细胞中能够有效表达,为后续构建转染人G250的基因细胞株工作奠定了基础。
- 李云奇朱晓明肖毅王伟李盼王宇王琳王琳徐元基阎瑾琦张巍于继云
- 关键词：G250真核表达质粒293T细胞肾肿瘤
- 乙肝治疗性可复制型DNA疫苗pSVK-HBVA高稳定宿主菌的筛选及其基础培养基的选择
- 2013年
- 目的为乙肝治疗性可复制型DNA疫苗质粒pSVK-HBVA筛选稳定性高,能多次传代的宿主菌,以满足中试工艺的要求,同时对该工程菌最适的基础发酵培养基进行选择。方法将质粒pSVK-HBVA分别转化几种不同的大肠杆菌感受态细胞并提取质粒,通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的形态结构,连续传代法对工程菌的稳定性进行检测;选取质粒含量最高和稳定性最好的工程菌作为原始种子,按照2010版《中国药典》要求建立工程菌的三级种子批,并对种子批进行鉴定。同时,从LB,TB,M9(甘油),M9(葡萄糖)4种培养基中为工程菌筛选质粒产量最高的基础发酵培养基。结果经过筛选发现,在以大肠杆菌XL10-Gold为宿主菌时,质粒pSVK-HBVA表现出了同常规质粒DNA类似的稳定性,转接传代30次也未发生重组或片段丢失,能满足后续中试工艺的要求,LB作为基础培养基能得到最高的质粒容积产率为5.5 mg/L。结论大肠杆菌XL10-Gold是一个更利于可复制型DNA疫苗质粒pSVK-HBVA扩增的宿主菌,该工程菌发酵的最佳基础培养基是LB培养基。
- 朱晓明王宇吴昊徐元基张巍王琳张亮李盼侯沙沙王启宇于继云阎瑾琦
- 关键词：宿主菌基础培养基
- 复制子荧光素酶表达质粒pSVK-luc的构建与应用被引量：1
- 2013年
- 目的为研究复制子DNA疫苗在生物活体内的表达情况,构建含有荧光素酶报告基因的复制子表达质粒pSVK-luc。方法 PCR扩增荧光素酶报告基因,克隆入DNA复制子载体pSVK,酶切鉴定和测序分析筛选阳性重组质粒pSVK-luc;化学法转染人胚肾293T细胞,流式细胞术和免疫荧光法检测荧光素酶基因在293T细胞中的表达;利用基因电穿孔导入仪递送重组质粒至BALB/c小鼠股四头肌,活体成像仪动态观测荧光素酶基因在小鼠体内的表达。结果 pSVK-luc经相应酶切和测序鉴定,与预期设计完全一致。流式细胞术和免疫荧光检测均可见荧光素酶基因表达;同时活体成像仪也能检测到该基因在小鼠体内的表达。结论 pSVK-luc表达质粒的构建成功将为复制子DNA疫苗体内作用机制研究和体内电穿孔递送条件的优化奠定实验基础。
- 李盼张亮王宇朱晓明张巍徐元基于继云阎瑾琦
- 关键词：荧光素酶基因活体成像
