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表达猪瘟病毒E2蛋白的三种重组腺病毒在兔体上的免疫效力比较被引量：1: 2010年; 为了筛选1株免疫效果好的候选猪瘟疫苗,在家兔模型上对表达猪瘟病毒E2基因的3种重组腺病毒(rAdV-E2、rAdV-optiE2和rAdV-E2UL49)进行了免疫效力评价,从抗体、攻毒后产生定型热反应以及兔脾中病毒载量等几个方面进行了比较。结果显示,rAdV-E2UL49免疫组(n=5)在免疫后第2周,3只家兔产生了特异性的猪瘟抗体,免疫后第4周,所有免疫家兔的抗体阻断率均达到了70%;相比之下,rAdV-E2和rAdV-optiE2免疫组(n=5)家兔在免疫后第4周,只有个别家兔检测到了猪瘟特异性抗体。用猪瘟弱毒疫苗(C株)攻毒后,rAdV-E2UL49免疫组家兔均未出现定型热反应,在其脾中也未检测到C株病毒RNA,其免疫效果接近于C株;rAdV-E2和rAdV-optiE2免疫组各有3只家兔出现了定型热反应,在个别兔的脾中检测到了病毒RNA。结果表明,伪狂犬病病毒UL49基因编码的VP22蛋白可以增强重组腺病毒的免疫原性,rAdV-E2UL49有望成为一株有潜力的猪瘟疫苗。; 孙元李宏宇张兴娟李伟杰梁冰冰李娜仇华吉; 关键词：猪瘟病毒重组腺病毒免疫效力比较家兔

新型嵌合病毒载体猪瘟疫苗的创制和评价: <正>猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种烈性传染病。现行的猪瘟兔化弱毒疫苗安全、有效,在全球猪瘟的防控中发挥了关键作用,但存在如下缺点:生产过程中受牛血清中污染的牛病毒性腹泻病毒及其抗体的影响、免疫效力受猪瘟母源抗体和其他弱毒疫...; 孙元田大勇袁晋秦华洋李宏宇李娜仇华吉; 文献传递

新型嵌合病毒载体猪瘟疫苗的创制和评价: 猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种烈性传染病.现行的猪瘟兔化弱毒疫苗安全、有效,在全球猪瘟的防控中发挥了关键作用,但存在如下缺点:生产过程中受牛血清中污染的牛病毒性腹泻病毒及其抗体的影响、免疫效力受猪瘟母源抗体和其他弱毒疫苗的干...; 孙元田大勇袁晋秦华洋李宏宇李娜仇华吉

猪瘟病毒NS3蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备被引量：6: 2010年; 以含有猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA的重组质粒pOKShimen为模板,经PCR扩增获得NS3基因,利用原核表达载体pMAL-c2X、pET32a以及杆状病毒表达载体pFastBacH T B表达CSFV石门株NS3基因,获得3种重组蛋白:MBP-NS3、His-NS3和rNS3。Western-blot分析及间接免疫荧光试验证实,这3种不同载体表达的NS3蛋白均能被猪瘟阳性血清所识别。利用直链淀粉树脂柱对重组蛋白MBP-NS3进行纯化后,用其免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,用间接ELISA筛选,获得2株能稳定传代并分泌针对抗CSFVNS3蛋白单克隆抗体的细胞株,命名为1D10和1H10。Western-blot分析及间接免疫荧光试验结果证明,这2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均可识别CSFVNS3蛋白。; 常天明孙元李宏宇贺番李淼黄俊华仇华吉; 关键词：猪瘟病毒单克隆抗体

共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因和猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒的构建及其在小鼠模型上的免疫原性分析被引量：6: 2010年; 本研究旨在以复制缺陷型人5型腺病毒为载体,构建一株同时表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株GP5蛋白和猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的重组腺病毒疫苗。首先利用重叠PCR将GP5和E2基因通过口蹄疫病毒(FMDV)2A序列连接,形成一个完整的ORF,并将其克隆到腺病毒穿梭载体中,通过细菌内同源重组构建共表达PRRSVGP5蛋白和CSFVE2蛋白的重组腺病毒(rAdV-GP52AE2)。间接免疫荧光试验和western blot检测证实2个外源基因均获得表达。在小鼠上进行的免疫效力评价结果显示,rAdV-GP52AE2免疫组针对CSFV的中和抗体滴度可达1∶128,针对PRRSV的中和抗体滴度为1∶16;在淋巴细胞增殖试验中,免疫组与阴性对照组在增殖指数上有显著差异,表明该重组腺病毒可以同时诱导抗PRRSV和CSFV的特异性体液免疫和细胞免疫。这些结果显示,利用具有自动剪切功能的FMDV2A多肽构建的重组腺病毒有望开发成一种同时预防PRRS和CSF的新型载体疫苗。; 李宏宇孙元常天明贺番黄俊华仇华吉; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒猪瘟病毒重组腺病毒免疫原性

猪瘟甲病毒复制子载体DNA疫苗与重组腺病毒活载体疫苗联合免疫效果评价被引量：7: 2009年; 本实验室先前分别将构建的猪瘟病毒E2基因重组腺病毒疫苗(rAdV-E2)和猪瘟甲病毒复制子载体DNA疫苗(pSFV1CS-E2)在猪体上进行了免疫效力评价,结果显示,rAdV-E2免疫组所有猪虽然在加强免疫后产生了比较高的猪瘟特异性中和抗体,但攻毒后个别猪表现短期体温升高和轻微病变;而pSFV1CS-E2免疫组猪只虽然在攻毒后得到了保护,但产生的抗体水平较低。为了增强猪瘟甲病毒复制子载体疫苗和猪瘟重组腺病毒活载体疫苗的免疫效果,本研究应用了复制子载体DNA疫苗初免和重组腺病毒疫苗加强免疫的初免-加强(Prime-boost)免疫策略,并在猪体上进行了评价。结果显示,所有免疫猪均产生了高水平的猪瘟特异性的中和抗体,用猪瘟强毒攻击后,pSFV1CS-E2初免组所有猪(n=5)均没有出现任何猪瘟的临床症状和病理变化,攻毒后在猪血液中也没有检测到猪瘟病毒RNA,而重组腺病毒初免组(n=5)有一头猪出现短期发热和病毒血症及轻微病理变化。这表明初免-加强免疫策略能显著提高重组疫苗的免疫效力。; 孙元刘大飞王宇飞李娜李宏宇梁冰冰仇华吉; 关键词：猪瘟 DNA疫苗重组腺病毒联合免疫

表达猪瘟病毒E2蛋白的重组腺病毒对猪的免疫效力评价被引量：7: 2009年; 为了进一步验证含有猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒(rAdV-E2)在猪体上的免疫效力,将rAdV-E2按108TCID50/头接种猪2次,同时用野生型腺病毒wtAdV作为阴性对照,当抗体上升到一定程度后用致死剂量的猪瘟强毒石门株进行攻击。结果表明,rAdV-E2免疫组(n=5)所有免疫猪在加强免疫后均产生了猪瘟特异性中和抗体,并于加强免疫后3w达到峰值,攻毒后所有猪只抗体迅速升高,除了一头猪短期体温升高外,未出现任何其它临床症状;而野生型腺病毒wtAdV免疫组(n=5)猪只在攻毒前一直没有检出特异性抗体,攻毒后全部出现典型的猪瘟临床症状和严重的病毒血症,剖检时可见典型猪瘟病理变化。这表明构建的猪瘟病毒E2基因重组腺病毒rAdV-E2免疫猪后产生了很好的免疫效果,有望成为具有开发价值的活载体疫苗。; 孙元刘大飞王宇飞李宏宇梁冰冰李娜仇华吉; 关键词：猪瘟病毒 E2基因重组腺病毒免疫效力

猪瘟兔化弱毒疫苗RT-LAMP检测方法的建立被引量：4: 2010年; 根据GenBank中登录的猪瘟病毒(CSFV)野毒株、猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的NS5B基因序列,利用在线软件Pri mer Explorer V4Software,设计了一套环介导逆转录等温核酸扩增(RT-LAMP)引物,建立了特异性检测HCLV的RT-LAMP方法。在BstDNA聚合酶作用下,65℃恒温反应1h即可完成扩增过程,扩增产物可通过20g/L琼脂糖凝胶电泳或加入SYBR GreenⅠ染料进行分析。经检测,该方法对于CSFV、BVDV以及其他猪源病毒无特异性扩增,具有良好的HCLV特异性;其灵敏度与本实验室建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测结果一致,均达到5个拷贝。分别用这两种方法对58份市售猪瘟弱毒疫苗进行检测,结果符合率达100%。表明,建立的HCLV RT-LAMP技术可以应用于基层实验室或养殖场,便于养殖户对疫苗中的弱毒含量进行监测。; 张兴娟韩秋影孙元李宏宇常天明石火英仇华吉; 关键词：猪瘟兔化弱毒疫苗猪瘟病毒

腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗及其应用: 本发明公开了腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗及其应用。本发明利用基因转移能力极强的腺病毒来递送表达猪瘟病毒E2蛋白的甲病毒复制子载体，构建了高效表达CSFV E2蛋白的腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体疫苗，其微生物保藏号...; 仇华吉孙元李娜李宏宇; 文献传递

稳定表达T7RNA聚合酶PK-15细胞系的建立被引量：1: 2011年; 为构建稳定表达T7RNA聚合酶(RNAP)的猪肾细胞系(PK-15),本研究采用PCR方法,以E.coliBL21(DE3)细菌基因组为模板扩增T7RNAP基因,将其克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒pLXSN-T7。采用脂质体将pLXSN-T7转染至PT67细胞中,经G418筛选培养获得重组逆转录病毒rMLV-T7,将其接种于PK-15细胞进行G418加压筛选和纯化;应用PCR、间接免疫荧光试验及T7启动子控制下的红色荧光蛋白的重组表达质粒(pET-RED)进行瞬时表达,检测T7RNAP的表达及活性,结果表明筛选所得的细胞系PK/T7的不同代次均具有转录活性。本研究建立稳定表达T7RNAP的细胞系PK/T7,为实现细胞内T7启动的转录和猪源RNA病毒等的反向遗传操作提供了有效的方法。; 黄俊华贺番孙元张鑫常天明李宏宇仇华吉; 关键词：逆转录病毒载体稳定细胞系

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李宏宇

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