徐志文
- 作品数：396 被引量：1,111H指数：14
- 供职机构：四川农业大学更多>>
- 发文基金：四川省科技支撑计划长江学者和创新团队发展计划国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生经济管理更多>>
- 猪NF-κB p65/p50亚基的原核表达及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响被引量：4
- 2013年
- 为了研究经原核表达的猪细胞核转录因子NF-κB p65/p50融合蛋白对猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)体外增殖影响,本文采用RT-PCR技术扩增出编码成熟p50区和p65开放阅读框(ORF),将其克隆至pET21a(+)中,转化至Rosetta感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和蛋白免疫印迹法(Western-blot)对表达产物进行鉴定;纯化复性后添加到DMEM细胞维持液中,观察p65/p50对Marc145细胞毒性,确定最佳使用浓度;探讨最佳浓度的p65/p50对PRRSV体外感染增殖活力的影响,通过实时荧光定量PCR方法研究PRRSV感染时相,绘制PRRSV增殖曲线。成功构建了大量以包涵体形式表达Mr均约为70kD的p65/p50融合蛋白的p65/p50-pET21a(+)原核表达载体;Western-blot显示p50和p65重组蛋白可分别与兔抗人p50多克隆血清、兔抗人p65纯化抗体反应。确定p65/p50最佳添加浓度为0.4μg/mL。通过实时荧光定量PCR技术研究PRRSV感染时相,结果表明NF-κB p65/p50可促进PRRSV感染Marc-145CPE出现及病毒早期增殖;但CPE出现后,病毒增殖受到抑制,病毒滴度水平显著降低(P<0.05)。该结果为进一步研究PRRS的发病机理及治疗策略提供了新思路。
- 王潇娣朱玲蔡雨函黄仆徐志文
- 关键词：核转录因子-ΚB猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒复制
- 一例猪蓝耳病的实验室诊断及NSP2、ORF5基因序列分析
- 2017年
- 为诊断四川眉山某猪场暴发的疑似猪蓝耳病。利用RT-PCR方法对其进行分子诊断,在确认为阳性结果的基础上针对PRRSV的ORF5和Nsp2基因分别设计特异性引物,扩增基因片段进行测序然后对其进行遗传进化分析。结果表明,该疫情由PRRSV引起,遗传进化分析表明该PPRSV毒株的ORF5和Nsp2无明显变异,现有防控措施有效。
- 李原野李凤琴徐志文朱玲
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征ORF5NSP2RT-PCR诊断
- 集约化猪场伪狂犬病综合防控技术研究
- 娄高明郭万柱朱玲廖筱萍徐志文王珣章王琴颜其贵彭广能黄健强付木水杨承槐钟卫民宋克军
- 该项目针对伪狂犬病给我国畜牧业特别是养猪业造成巨大经济损失，以及疫苗与检测技术的现状，利用生物技术研制出我国第一个完全拥有自主知识产权的动物病毒基因工程疫苗伪狂犬病基因缺失疫苗，构建了猪瘟伪狂犬病和猪细小病毒病伪狂犬病2...
- 关键词：
- 关键词：伪狂犬病基因工程疫苗综合防控技术
- 亲环蛋白A对日本脑炎病毒体外复制能力的影响
- 2015年
- 为研究亲环蛋白A(CyPA)对日本脑炎病毒(JEV)体外增殖能力的影响,构建了真核重组质粒pcDNA3.1-CyPA,并将其转染至BHK21细胞内,接种JEV后于不同时间点收集细胞上清液,采用荧光定量RT-PCR检测各时间点的病毒含量,绘制体外增殖曲线;同时检测不同质量浓度的CyPA原核表达蛋白对JEV复制的影响。结果显示,加入CyPA原核表达蛋白组的上清中病毒含量均显著高于对照组。结果表明,CyPA可以促进JEV的体外复制,为进一步揭示CyPA在JEV感染和致病机制中的作用及JEV抗病毒药物的研发或疫苗的大量生产奠定了一定的理论基础。
- 蔡雨函韩燕刘红亮刘小琬朱玲徐志文
- 关键词：日本脑炎病毒荧光定量
- 猪轮状病毒四川株的分离鉴定及增殖规律被引量：8
- 2014年
- 为了解猪轮状病毒（PoRV）在MARC-145细胞系上的培养特性及增殖规律，本试验利用MARC-145细胞，从四川仔猪腹泻样品中分离到1株PoRV，并通过PCR检测、病毒理化实验与微量中和实验证实，命名为SC-R株。用含不同浓度胰酶营养液培养SC-R株48h后，分别收集病毒液进行定量分析；同时，以SC-R分离株感染MARC-145细胞，在感染后不同时间分别收集感染病毒液，利用PoRV荧光定量检测方法对不同样品中病毒RNA进行定量分析，绘制PoRV生长曲线。结果表明，用含3％胰酶营养液培养的细胞液中PoRV的RNA含量明显高于其他组；-步生长曲线显示细胞外病毒RNA含量呈“s型”曲线增长，感染后0～8h为潜伏期，病毒RNA含量维持在较低水平；8～36h为突破期，病毒RNA含量呈对数增长；感染48h增长速度减缓，维持在较高水平，逐步进入稳定期。胰酶可增加PoRV对细胞的感染性，3％是本试验最为适用的胰酶浓度；PoRV感染MARC-145后在细胞内增殖并逐步释到细胞外。
- 杨文宇朱玲周远成郭万柱徐志文
- 关键词：TCID50胰酶
- 猪流感病毒M2多肽抗体间接ELISA检测方法的建立被引量：1
- 2015年
- 为建立快速检测猪流感病毒抗体的血清学方法,利用合成的甲型流感病毒M2蛋白多肽作为包被抗原,建立了检测猪流感病毒血清抗体的间接ELISA,并对各种检测条件进行了优化。结果显示,优化后确定的抗原最适包被量为250ng/孔,血清最佳稀释度为1∶100,酶标二抗最佳稀释度为1∶4 000。在优化条件下,阴阳性临界值的判定标准为0.249。用建立的间接ELISA对CSFV、PRRSV、PCV2、PPV、PRV、FMDV、JEV阳性血清进行了检测,均无交叉反应。用该方法对280份冬季采集的猪血清样品进行检测,有60份样品呈现阳性;同时用IDEXX甲型流感病毒抗体检测试剂盒进行平行检测,有61份样品呈现阳性,两者的符合率达到98.35%。结果表明,建立的ELISA具有良好的敏感性、特异性和可信度。本研究为猪流感的诊断和流行病学调查提供了一种准确、快速、简便的方法。
- 刘红亮周远成刘小琬李萍周桐枫徐志文朱玲杨泽晓
- 关键词：猪流感病毒间接ELISA
- 猪圆环病毒Ⅱ型ORF3基因缺失突变毒株对仔猪的致病性及免疫原性研究被引量：8
- 2008年
- 15头28～30日龄健康仔猪分成A、B、C3组（5头／组），分别肌注接种PCV2ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C、亲本毒株PCV2-CD以及生理盐水。用PCR-RFLP和PCR方法，分别从A组和B组屠宰仔猪的腹股沟淋巴结中特异性检测到mPCV2-C和PCV2-CDDNA，发现mPCV2-C能够在仔猪体内复制增殖。组织病理学结果表明；A组和B组腹股沟淋巴结、肝细胞及肺泡壁上皮细胞呈现病变，其中B组病变较严重，证实ORF3基因缺失未改变PCV2的组织嗜性。外周血T淋巴细胞亚群含量动态检测结果表明：与C组相比，A组、B组外周血CD3^＋、CD4^＋细胞百分含量降低，而A组CD8^＋细胞于免疫后第14天回升，高于B组和C组，表明ORF3基因缺失使病毒对T淋巴细胞亚群的影响有所减弱，并有诱导仔猪细胞免疫应答的趋势。上述结果提示ORF3缺失致使病毒的致病力有降低的趋势。PCV2抗体动态检测发现：mPCV2-C明显诱导了仔猪的体液免疫，具有良好的免疫原性。mPCV2-C可作为PCV2基因缺失疫苗候选毒株。
- 杨晓农郭万柱徐志文朱玲王新曾秀王小玉
- 关键词：ORF3基因基因缺失免疫原性
- 猪环曲病毒N基因的克隆及生物信息学分析被引量：1
- 2015年
- 为研究猪环曲病毒(PToV)N蛋白的生物信息学特征,运用RT-PCR技术扩增猪环曲病毒N基因,测序并对其进行生物信息学分析。结果成功获得了492bp的PToV N基因(GenBank登录号为KM036209)。经生物信息学分析,此序列编码163个氨基酸,理论等电点(pI)为12.14,理论分子质量为18 695.5u,不稳定系数为77.47;不同密码子对同一氨基酸选择上呈现一定的偏嗜性;最大疏水指数为1.589,最小疏水指数为-3.533;无信号肽和跨膜区;抗原表位主要位于N末端和C末端。预测其可能包含4个N-糖基化作用位点,2个蛋白激酶C磷酸化作用位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点、1个N-豆蔻酰化位点。进化树分析结果显示,KM036209与韩国株和上海株亲缘关系很接近,与荷兰及西班牙株不属于同一分支。
- 周桐枫周璐周远成刘小琬徐志文朱玲郭万柱
- 关键词：N基因克隆生物信息学分析
- 中药防治仔猪腹泻被引量：1
- 2018年
- 1腹泻分型
仔猪幼小,脾胃发育未成熟,机体调节能力差,易受湿邪侵袭,水湿纳运失常,湿热互结,可致肠道功能紊乱而腹泻.仔猪腹泻可分为以下5种类型：由感寒湿引起,病猪以发病急,排白色清稀、腥味大的粪便为特征的虚寒腹泻,对其常以二苓平胃散施治,泄泻较重则加乌梅、泽泻、车前子等以止泻;由感暑湿所致,病猪以腹痛.
- 王晨曦王袁斐懿杨钰楚蒲锋许思遥徐志文
- 关键词：仔猪腹泻中药防治平胃散病猪肠道
- 共表达猪IFN-γ基因对PPV VP2-PCV ORF2真核质粒的分子免疫佐剂效应研究被引量：3
- 2010年
- 将干扰素-γ、猪圆环病毒Ⅱ型ORF2主要抗原表位(47-85位AA)和猪细小病毒VP2基因克隆至pCI-neo真核载体中,构建重组质粒pCI-IFN-γ.ORF2.VP2。用脂质体介导法将其转染到MDBK细胞中,利用RT-PCR和间接免疫荧光法检测产物的表达情况。将重组质粒pCI-IFN-γ.ORF2.VP2、pCI-ORF2.VP2、对照质粒pCI-neo、PBS、猪细小病毒灭活苗和猪圆环病毒亚单位疫苗通过肌肉注射免疫小鼠,检测小鼠不同时期的淋巴细胞转化功能、T淋巴细胞亚群动态变化情况以及PPV、PCV2抗体水平。试验结果显示,在转染重组质粒的MDBK细胞中能扩增到ORF2-VP2和IFN-γ基因;转染后48h用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达。pCI-IFN-γ.ORF2.VP2免疫组从第7天开始脾淋巴细胞对ConA有明显反应,显著高于对照组和PCI-ORF2.VP2免疫组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组和pCI-ORF2.VP2免疫组;在免疫后第14天检测到PPV PCV抗体。结果表明,pCI-IFN-γ.ORF2.VP2能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。
- 陈燕凌徐志文郭万柱朱玲徐凯唐玉香
- 关键词：VP2基因ORF2基因IFN-Γ基因
