绳纪坡
- 作品数：29 被引量：36H指数：4
- 供职机构：军事医学科学院生物工程研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学更多>>
- AA12(LG21)可溶性表达研究及抗体制备被引量：7
- 2003年
- 用PCR技术从AA12基因上扩增出LG21(100～498bp)片段,并克隆到原核表达载体pET-28a(+)上;转化大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达研究,使其在大肠杆菌中能够可溶性表达,优化表达条件获得表达量比较高的LG21蛋白;用镍离子螯和柱(Ni-NTA)纯化LG21蛋白,获得纯度较高的蛋白。用纯蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,ELISA结果显示效价可达到1∶163840;Western结果表明该抗体可以与LG21蛋白特异结合;为进行免疫共沉淀实验,验证Chk1蛋白与AA12蛋白在体内的相互作用奠定了基础。
- 刘爽胡宝成绳纪坡田媛
- 关键词：多克隆抗体差异表达基因抗辐射性可溶性表达PCR技术
- 人MEPE基因稳定表达细胞系的建立及MEPE蛋白在DNA损伤应答中的功能初探被引量：1
- 2010年
- 目的构建人MEPE基因真核表达载体,稳定转染人胚肾293T细胞,并建立稳定表达细胞株;初步探讨人MEPE蛋白在DNA损伤应答中的作用。方法将人MEPEcDNA克隆至带有HA标签的真核表达载体pREP10上,构建重组质粒;分别将载体pREP10/MEPE-HA和pREP10/HA转染293T细胞;经潮霉素B加压筛选阳性克隆;用RT-PCR和免疫印迹方法分别在RNA水平和蛋白水平鉴定稳定表达MEPE-HA融合蛋白的阳性细胞株;利用一定浓度的DNA损伤诱导剂喜树碱(camptothecin,CPT)处理细胞,通过MTT比色法检测不同时间点细胞存活率的变化,其趋势即可反映出不同细胞株对DNA损伤诱导剂的敏感性。结果经酶切鉴定及序列分析,人MEPE基因真核表达载体pREP10/MEPE-HA构建正确,转染人293T细胞,筛选出MEPE表达较高的细胞株,并且发现该基因的高表达可以使细胞对DNA损伤诱导剂的耐受性提高。结论成功建立了稳定表达人MEPE的293T细胞株,并对人MEPE蛋白在细胞中对DNA损伤诱导剂敏感性的影响进行了初步探讨,为进一步研究MEPE的功能奠定了基础。
- 高宁绳纪坡于芳林宇翔马祖兴胡宝成
- 关键词：基因表达细胞系DNA损伤
- 脆性组氨酸三联体基因小干扰RNA的构建及干扰效果检测
- 2010年
- 目的:构建脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的小干扰RNA(siRNA),并检测其对293T细胞内源性FHIT基因表达的干扰效果。方法:根据FHIT基因序列,通过生物信息学网站预测可能的siRNA,从中筛选出2条合理的FHIT-siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer2.1-U6Hygro中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆进行测序鉴定;将构建成功的FHIT-siRNA重组载体转染人胚肾细胞293T,Western印迹检测siRNA对293T内源性FHIT表达的干扰效果。结果:构建了2个FHIT-siRNA重组质粒,2条siRNA都有干扰作用,其中一条的作用效果可达50%以上。结论:构建的FHIT-siRNA为进一步研究FHIT的功能提供了有利的工具。
- 林宇翔于芳绳纪坡高宁马祖兴胡宝成
- 关键词：脆性组氨酸三联体基因小干扰RNA
- 作为肾素-血管紧张素系统调节器和SARS病毒受体的人血管紧张素转换酶2被引量：2
- 2005年
- 人血管紧张素转换酶2(ACE2)是目前已知的惟一的人血管紧张素转换酶(ACE)的同源物,是一种新型的金属羧肽酶,很多特性与ACE截然不同。ACE2在肾素-血管紧张素系统(RAS)中具有独特的作用,调节心脏功能和机体血压。最近ACE2被鉴定为SARS病毒的功能受体。ACE2已经成为目前药物研发的新靶点。对ACE2的认识才刚刚开始,有待进一步深入研究。
- 林福玉绳纪坡邓继先
- 关键词：SARS病毒功能性受体药物靶标
- 人MEPE/OF45基因的克隆及序列分析被引量：1
- 2008年
- 目的:克隆人MEPE/OF45全长基因,为进一步研究MEPE/OF45在DNA损伤应答中的作用及特异的信号通路奠定基础。方法:选取人宫颈癌细胞HeLa为靶细胞,从中提取总RNA,设计扩增人MEPE/OF45基因片段的特异引物,进行RT-PCR分析;用蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮(CHX)对细胞进行处理,观察处理前后MEPE/OF45基因的表达情况。结果:在经CHX处理的HeLa细胞中扩增到了MEPE/OF45基因片段,随后利用重叠PCR方法获得了人MEPE/OF45全长基因,并经序列分析确证。结论:获得了人MEPE/OF45基因片段及全长基因,为阐明MEPE/OF45在细胞中复杂的功能提供了线索。
- 张鸿声高宁绳纪坡于芳张宏达张勇胡宝成
- 关键词：克隆HELA细胞
- 靶向细胞外基质磷酸糖蛋白的microRNA的筛选及鉴定
- MEPE(细胞外基质磷酸糖蛋白)是2000年发现的与骨代谢和磷酸盐平衡有关的蛋白,我们发现了该基因的一个新功能,即与DNA损伤应答有关。为了更好的研究该基因的功能,本研究鉴定了靶向Mepe基因的microRNA,并检测其...
- 罗维林宇翔绳纪坡于芳胡宝成
- 文献传递
- 脆性组氨酸三联体与复制蛋白A相互作用关键氨基酸残基的鉴定被引量：4
- 2008年
- 目的:研究脆性组氨酸三联体(Fhit)对ATR/CHK1通路的影响,在确定Fhit与复制蛋白A(RPA)存在相互作用的基础上鉴定Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基,为进一步研究Fhit特异的信号通路奠定基础。方法:构建一系列Fhit缺失突变体基因Fhit1～Fhit11及6种Fhit点突变体基因,将这些基因插入含GST基因的原核表达载体中,在大肠杆菌中表达并纯化GST-Fhit1～GST-Fhit11融合蛋白、突变体GST-FhitSIYEEL、GST-FhitIY、GST-FhitEL、GST-FhitF、GST-FhitA,以及GST-FhitD融合蛋白,用GST沉降技术研究Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基。结果:Fhit蛋白第112～117(SIYEEL)残基可能是Fhit与RPA相互作用的关键区域,而第114(Y)残基可能是Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基。结论:确定了Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基,为阐明Fhit在维持基因组完整性方面的机理提供了线索。
- 张勇于芳张宏达绳纪坡高宁张鸿声胡宝成
- 关键词：脆性组氨酸三联体蛋白相互作用
- 大鼠丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂B2的表达、纯化及抗体制备被引量：1
- 2011年
- 目的:原核表达、纯化大鼠丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂B2(SERPINB2),并制备其多克隆抗体。方法:设计扩增大鼠Serpinb2全长基因的特异引物,通过PCR扩增出该基因片段,测序正确后插入含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果:原核表达了大鼠Serpinb2全长基因,纯化了SERPINB2蛋白,并获得了抗SERPINB2的多克隆抗体,抗体效价达到1:25600,Western印迹结果显示该抗体能特异识别原核及真核细胞表达的SERPINB2。结论:SERPINB2能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究SERPINB2的功能奠定了基础。
- 马祖兴高宁于芳林宇翔绳纪坡胡宝成
- 关键词：纯化多克隆抗体
- 受控型蜕皮激素诱导表达截短型hIGF-Ⅰ转基因载体的构建及其在细胞水平上的有效性检测
- 2006年
- 目的:构建一种可以在哺乳动物细胞中蜕皮激素诱导表达截短型hIGF-Ⅰ的受控型转基因载体,为制备受控型蜕皮激素诱导表达截短型hIGF-Ⅰ的转基因小鼠奠定基础。方法:利用分子克隆技术构建受控型蜕皮激素诱导表达截短型hIGF-Ⅰ的转基因载体;将其电转至AM1菌中,利用其中的Cre重组酶将载体上两个同向LoxP序列锚定的新霉素(neomycin)基因删除,解除其对蜕皮激素诱导表达系统的阻断作用,利用PCR、酶切和测序鉴定删除情况;将重组后的载体转染至COS7细胞中进行瞬间表达,蜕皮激素诱导后回收培养上清和细胞裂解物进行W est-ern印迹分析,检测hIGF-Ⅰ的表达情况。结果和结论:成功构建大小为13.6 kb的转基因载体pCE-IGF-Ⅰ;转化至AM1中后,PCR、酶切和测序的结果都证明其中的Cre酶能够将载体上neomycin基因删除;重组后的载体转染至COS7细胞中进行诱导表达,W estern印迹实验证明截短型hIGF-Ⅰ能够在COS7细胞中顺利表达。上述结果证明该蜕皮激素诱导表达截短型hIGF-Ⅰ的受控型转基因载体能够用于转基因小鼠的制备。
- 绳纪坡藤艳杨晓邓继先
- 关键词：蜕皮激素转基因转染
- 脆性组氨酸三联体突变体在DNA损伤应答中的作用机制
- 2013年
- 目的:用建立的稳定表达脆性组氨酸三联体(Fhit)突变体的细胞株,研究Fhit与复制蛋白A(RPA)之间的相互作用对细胞在DNA损伤后的影响。方法:用电离辐射或DNA损伤诱导剂喜树碱处理稳定表达Fhit突变体的阳性细胞株HeLa-FhitA/D/F后,通过流式细胞技术、MTT比色法及克隆形成实验,检测这些细胞系的细胞周期变化情况以及对DNA损伤诱导剂的敏感性。结果:DNA损伤诱导剂处理后,Fhit突变体基因的高表达可以使细胞表现出更强的G2期阻滞及对DNA损伤诱导剂更耐受。结论:Fhit与RPA相互作用的改变影响了细胞对DNA损伤诱导剂的耐受性,为阐明Fhit在维持基因组完整性方面的机理提供了线索。
- 于芳绳纪坡胡宝成
- 关键词：脆性组氨酸三联体突变体
