林宇翔
- 作品数：9 被引量：4H指数：1
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- 肿瘤睾丸抗原CT45-5在DNA损伤应答中的作用
- 2013年
- 目的:用建立的CT45-5-siRNA研究肿瘤睾丸抗原CT45-5在DNA损伤应答中的作用。方法:通过靶向CT45-5基因小干扰RNA(siRNA)下调CT45-5的表达,用MTT比色法检测经喜树碱和依托泊苷处理后细胞对DNA损伤诱导剂的敏感性,用流式细胞技术检测电离辐射后细胞周期的变化。结果:在DNA损伤诱导剂处理后,在脆性组氨酸三联体(Fhit)高表达细胞中下调CT45-5的表达可以使细胞表现出更强的G2期阻滞及对DNA损伤诱导剂更耐受,而在Fhit缺失表达的细胞中却没有此现象。结论:CT45-5可能是以Fhit依赖的途径参与了DNA损伤应答。
- 柯波绳纪坡于芳林宇翔罗维胡宝成
- 关键词：RNA干扰脆性组氨酸三联体
- 人MEPE基因稳定表达细胞系的建立及MEPE蛋白在DNA损伤应答中的功能初探被引量：1
- 2010年
- 目的构建人MEPE基因真核表达载体,稳定转染人胚肾293T细胞,并建立稳定表达细胞株;初步探讨人MEPE蛋白在DNA损伤应答中的作用。方法将人MEPEcDNA克隆至带有HA标签的真核表达载体pREP10上,构建重组质粒;分别将载体pREP10/MEPE-HA和pREP10/HA转染293T细胞;经潮霉素B加压筛选阳性克隆;用RT-PCR和免疫印迹方法分别在RNA水平和蛋白水平鉴定稳定表达MEPE-HA融合蛋白的阳性细胞株;利用一定浓度的DNA损伤诱导剂喜树碱(camptothecin,CPT)处理细胞,通过MTT比色法检测不同时间点细胞存活率的变化,其趋势即可反映出不同细胞株对DNA损伤诱导剂的敏感性。结果经酶切鉴定及序列分析,人MEPE基因真核表达载体pREP10/MEPE-HA构建正确,转染人293T细胞,筛选出MEPE表达较高的细胞株,并且发现该基因的高表达可以使细胞对DNA损伤诱导剂的耐受性提高。结论成功建立了稳定表达人MEPE的293T细胞株,并对人MEPE蛋白在细胞中对DNA损伤诱导剂敏感性的影响进行了初步探讨,为进一步研究MEPE的功能奠定了基础。
- 高宁绳纪坡于芳林宇翔马祖兴胡宝成
- 关键词：基因表达细胞系DNA损伤
- 脆性组氨酸三联体基因小干扰RNA的构建及干扰效果检测
- 2010年
- 目的:构建脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的小干扰RNA(siRNA),并检测其对293T细胞内源性FHIT基因表达的干扰效果。方法:根据FHIT基因序列,通过生物信息学网站预测可能的siRNA,从中筛选出2条合理的FHIT-siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer2.1-U6Hygro中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆进行测序鉴定;将构建成功的FHIT-siRNA重组载体转染人胚肾细胞293T,Western印迹检测siRNA对293T内源性FHIT表达的干扰效果。结果:构建了2个FHIT-siRNA重组质粒,2条siRNA都有干扰作用,其中一条的作用效果可达50%以上。结论:构建的FHIT-siRNA为进一步研究FHIT的功能提供了有利的工具。
- 林宇翔于芳绳纪坡高宁马祖兴胡宝成
- 关键词：脆性组氨酸三联体基因小干扰RNA
- 靶向细胞外基质磷酸糖蛋白的microRNA的筛选及鉴定
- MEPE(细胞外基质磷酸糖蛋白)是2000年发现的与骨代谢和磷酸盐平衡有关的蛋白,我们发现了该基因的一个新功能,即与DNA损伤应答有关。为了更好的研究该基因的功能,本研究鉴定了靶向Mepe基因的microRNA,并检测其...
- 罗维林宇翔绳纪坡于芳胡宝成
- 文献传递
- 大鼠丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂B2的表达、纯化及抗体制备被引量：1
- 2011年
- 目的:原核表达、纯化大鼠丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂B2(SERPINB2),并制备其多克隆抗体。方法:设计扩增大鼠Serpinb2全长基因的特异引物,通过PCR扩增出该基因片段,测序正确后插入含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果:原核表达了大鼠Serpinb2全长基因,纯化了SERPINB2蛋白,并获得了抗SERPINB2的多克隆抗体,抗体效价达到1:25600,Western印迹结果显示该抗体能特异识别原核及真核细胞表达的SERPINB2。结论:SERPINB2能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究SERPINB2的功能奠定了基础。
- 马祖兴高宁于芳林宇翔绳纪坡胡宝成
- 关键词：纯化多克隆抗体
- 靶向细胞外基质磷酸糖蛋白的microRNA的筛选及鉴定
- 罗维林宇翔绳纪坡于芳胡宝成
- 人细胞外基质磷酸糖蛋白MEPE的表达纯化及抗体制备被引量：1
- 2011年
- 目的原核表达、纯化人细胞外基质磷酸糖蛋白(Mepe)基因,并制备多克隆抗体。方法设计出扩增人Mepe全长基因的特异引物,通过PCR扩增出该基因片段,测序正确后插入到含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果原核表达了人Mepe全长基因,纯化了MEPE蛋白,并获得了抗MEPE的多克隆抗体,抗体效价达到1∶25 600,Western印迹结果显示,该抗血清能够特异识别原核及真核细胞表达的MEPE蛋白。结论 MEPE蛋白能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究MEPE的功能奠定了基础。
- 马祖兴高宁绳纪坡于芳林宇翔罗维柯波胡宝成
- 关键词：细胞外基质磷酸糖蛋白表达纯化多克隆抗体
- 肿瘤睾丸抗原CT45-5基因小干扰RNA表达载体的构建及干扰效果鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的:构建肿瘤睾丸抗原CT45家族中5号成员基因(CT45-5)的小干扰RNA(siRNA),并检测其对HeLa及HeLa/Fhit细胞内源性CT45-5基因及外源脆性组氨酸三联体(Fhit)基因表达的干扰效果。方法:根据CT45-5基因序列,通过生物信息学方法对靶向CT45-5基因的siRNA进行预测,从中筛选出2对合理的CT45-5-siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer 2.1-U6 Hygro中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆进行测序鉴定;将构建的CT45-5-siRNA重组载体转染人宫颈癌细胞HeLa及HeLa/Fhit细胞,Western印迹检测siRNA对HeLa及HeLa/Fhit细胞内源性CT45-5及外源Fhit基因表达的干扰效果。结果:构建了2个CT45-5-siRNA重组质粒,其中一条对CT45-5基因具有明显的干扰作用,并且Fhit基因表达也被抑制。结论:构建的CT45-5-siRNA为与CT45-5功能相关的基因研究奠定了基础。
- 柯波林宇翔绳纪坡于芳罗维马祖兴胡宝成
- 关键词：小干扰RNA脆性组氨酸三联体
- 靶向细胞外基质磷酸糖蛋白的microRNA的筛选及鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的:寻找靶向细胞外基质磷酸糖蛋白(MEPE)基因的微小RNA(miRNA),并检测其对人HeLa细胞内源性Mepe基因表达的影响。方法:通过NCBI检索人源Mepe的3'UTR,利用miRNA预测工具TargetScan预测可能靶向Mepe的所有miRNA,通过双萤光素酶报告基因系统检测miRNA与Mepe3'UTR的结合情况,从而初步筛选出可能靶向Mepe的miRNA;同时,用Western印迹检测miRNA经转染后对Mepe基因表达的影响。结果:利用TargetScan预测出36条可能靶向Mepe的miRNA,根据分值及匹配情况从中挑选出6条进行验证;与转染空载体pGL3-cm的相对荧光素值相比,转染miR-376a的相对荧光素值降低较为明显,而当Mepe3'UTR与miR-376a结合位点突变后,miR-376a不能抑制萤光素酶的活性;Western印迹结果显示miR-376a能明显抑制MEPE的表达。结论:miRNA-376a可能是靶向Mepe基因的miRNA,为进一步研究MEPE的功能奠定了基础。
- 罗维林宇翔绳纪坡于芳柯波胡宝成
- 关键词：细胞外基质磷酸糖蛋白微小RNA靶向
