江鹰
- 作品数：10 被引量：22H指数：2
- 供职机构：第四军医大学实验动物中心更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金陕西省自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学文化科学更多>>
- 复苏促进因子结合蛋白A的原核表达及对耻垢分枝杆菌的促生长作用被引量：2
- 2010年
- 目的:在大肠埃希氏菌中表达结核分枝杆菌复苏促进因子结合蛋白A(resuscitation-promoting factor-interacting protein A,RipA),观察该蛋白对耻垢分枝杆菌的促生长作用。方法:采用PCR方法,从结核分枝杆菌H37Rv的DNA中扩增出编码RipA蛋白的Rv1477基因,测序正确后克隆入原核表达载体pProEx HTa,构建重组表达质粒pProEx HTa-RipA。以重组质粒转化大肠杆菌DH5a,筛选阳性重组菌株,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside IPTG)诱导RipA表达,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化。将纯化的RipA蛋白加入到耻垢分枝杆菌中,分光光度法测定细菌的A600,观察RipA蛋白的促生长作用。结果:成功扩增了Rv1477基因,并克隆于表达载体pProEx HTa中,经酶切鉴定获得阳性克隆。经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子量为52kDa的目的蛋白,Western-blot结果显示该蛋白与6×His单抗有特异性的反应条带。采用Ni+-NTA柱可获得纯化的目的蛋白。100pM的RipA蛋白可显著促进耻垢分枝杆菌休眠菌的复苏和生长。结论:RipA蛋白在大肠杆菌中成功表达,并能有效促进耻垢分枝杆菌的生长。
- 师长宏赵勇毛峰峰张海白冰江鹰
- 关键词：结核分枝杆菌休眠
- 科研模型促进实验动物学教学的探索
- 调整实验动物学课程内容,突出科研特色,增加动物实验课新内容,强化学员的操作技能,突出以学员为主体的教学方式,扩展学生的科研思维,从而培养学生的创新思维能力。
- 江鹰张彩勤师长宏
- 关键词：实验动物学教学模式
- 文献传递
- 结核分枝杆菌Rv1759c结构域与IL-2融合蛋白的表达与鉴定被引量：1
- 2011年
- 目的:构建结核分枝杆菌(MTB)Rv1759c结构域(Rv1759cD domain,Rv1759cD)与人IL-2(hIL-2)融合基因,并在大肠杆菌中表达获得重组的融合蛋白Rv1759cD-IL-2。方法:用PCR方法从MTB H37Rv基因组扩增Rv1759cD基因片段,测序后与hIL-2基因构建融合基因,并克隆到表达载体pProEX HTa。融合基因在大肠杆菌DH5α中诱导表达,经SDS-PAGE分析后,分别与His mAb、IL-2mAb和结核病人血清进行Western-blot鉴定,采用Ni-NTA亲和层析纯化蛋白。结果:获得的Rv1759cD基因经测序与GenBank公布的序列完全一致,与hIL-2基因连接后,构建的融合基因在大肠杆菌中有效表达。表达蛋白相对分子量为30KDAa,与预测值相符;Western-blot结果显示,在相对分子量30KDAa处分别与His mAb和鼠抗IL-2 mAb形成结合带,并与结核病人血清出现特异性结合。通过Ni-NTA亲和层析,可得到纯化的目的蛋白。结论:成功表达、纯化和鉴定了Rv1759cD-IL-2融合蛋白,并有可能作为新型结核病疫苗的靶抗原。
- 师长宏江鹰毛峰峰赵勇张彩勤赵善民白冰陈涛
- 关键词：结核分支杆菌IL-2
- 结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达、纯化与鉴定
- 2011年
- 目的构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)RpfA的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达、纯化和鉴定。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出编码RpfA蛋白的Rv0867c基因,通过克隆载体pMD18-T构建质粒载体pMD18-T-Rv0867c。经酶切和DNA序列测定证实正确后,将Rv0867c基因克隆到pET32a(+)载体并在大肠杆菌BL21中诱导表,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与文献报道一致。Western-blot结果显示,在相对分子量约102 kDa处有分别与Anti-His单抗、Rpf结构域单抗和TB病人血清特异性结合带。结论成功表达、鉴定和纯化了RpfA蛋白。
- 赵善民江鹰赵勇毛峰峰张彩勤郭晓雅白冰师长宏
- 关键词：结核分枝杆菌纯化
- 结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3的表达、纯化和鉴定被引量：4
- 2010年
- 目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与Hsp16.3在大肠杆菌中融合表达并对其进行纯化和鉴定。方法采用PCR方法从质粒pProEX HTb-Hsp16.3扩增Hsp16.3基因,引入48bp的柔性linker结构以确保两蛋白的正确折叠。将目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。将测序正确的基因片段双酶切后,替换质粒pProEX HTa-Ag85B-ESAT6中的ESAT6基因,从而获得重组质粒pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3,并转化入大肠杆菌DH5α。经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B多抗和抗Hsp16.3单抗以及活动期结核病人血清进行Western blot分析鉴定,采用镍柱亲合色谱法对融合蛋白进行纯化。结果 PCR扩增获得的目的基因与GenBank报道的一致。SDS-PAGE分析显示构建的融合蛋白在大肠杆菌中表达,且该融合蛋白能够分别与抗Ag85B多抗和抗Hsp16.3单抗以及结核病人血清反应。该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析可获得纯化的Ag85B-Hsp16.3融合蛋白。结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究其生物学功能提供了基础。
- 杨巍师长宏赵佐庆赵勇江鹰
- 关键词：AG85BHSP16.3融合蛋白原核表达纯化
- 结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10的表达、纯化和鉴定
- 2012年
- 克隆结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出CFP10基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌BL21中表达。表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。成功克隆了CFP10基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得36 kD纯化蛋白,与文献报道相符,该蛋白可与CFP10 mAb特异结合,并且同时与活动期结核病人血清发生反应。成功获得了纯化的CFP10蛋白,为进一步研究CFP10蛋白的致病机理提供了实验依据。
- 江鹰尚淑琴赵勇毛峰峰赵善民张彩勤师长宏
- 关键词：结核分枝杆菌CFP10纯化
- 结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白影响小鼠巨噬细胞自噬形成的实验研究被引量：12
- 2011年
- 目的:观察热休克蛋白Hsp16.3对感染结核分枝杆菌(MTB)的巨噬细胞自噬体形成的作用。方法:以50 ng/μL雷帕霉素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬体形成后,用结核分枝杆菌毒株H37Rv感染巨噬细胞,再用Hsp16.3蛋白作用于巨噬细胞,电镜观察自噬体相成的变化,抗酸染色观察胞内细菌形态,计数MTB的菌落数。提取巨噬细胞总蛋白,Western blot方法检测自噬相关蛋白LC3表达水平的变化。结果:雷帕霉素诱导巨噬细胞形成自噬后感染结核分枝杆菌可使胞内细菌局限化,加入Hsp16.3蛋白可明显抑制了自噬体的形成,影响了结核分枝杆菌在巨噬细胞内的生存,显著增加了细菌的菌落形成单位,降低了自噬相关蛋白LC3的表达(P<0.05)。结论:Hsp16.3蛋白可能通过调节Atg8的表达水平抑制自噬体的形成。
- 师长宏江鹰赵勇毛峰峰张彩琴白冰张海
- 关键词：结核分枝杆菌自噬
- 结核分枝杆菌Hsp16.3单克隆抗体的制备及其特性鉴定被引量：1
- 2012年
- 制备抗结核分枝杆菌Hsp16.3的单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。将含目的基因的表达载体pProEXHTb-Hsp16.3,通过E.coli DH5α诱导表达,获得含有6×His的Hsp16.3蛋白,采用Ni-NTA纯化试剂盒进行目的蛋白的纯化,并用透析方法进行蛋白复性。将复性的蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株。将获得的Hsp16.3阳性杂交瘤细胞株分别利用间接ELISA法和Western blot方法进行效价、相对亲和力及特异性的测定。获得了三株Hsp16.3的单克隆抗体,分别命名为3H6F9、1D5E1和4H8G6,其效价分别为1:1×107、1:1×106和1:1×106,相对亲和力分别为0.000 1 mg/mL、0.001 mg/mL和0.001 mg/mL,并且无交叉反应性。所获得的结核分枝杆菌Hsp16.3的单克隆抗体效价高、特异性强,为进一步研究Hsp16.3在结核分枝杆菌潜伏感染中的作用提供了有效的工具。
- 张彩勤江鹰赵勇毛峰峰赵善民白冰师长宏
- 关键词：结核分枝杆菌HSP16.3单克隆抗体
- HBHA在结核病研究中的应用被引量：2
- 2012年
- 结核分枝杆菌hbhA编码基因是目前发现的与肺外结核转移相关的基因,其表达产物结核分枝杆菌肝素结合血凝黏附素(HBHA),是结核分枝杆菌表面表达和分泌的一种糖蛋白。HBHA具有介导肺结核和肺外结核的发生,参与实现MTB逃逸吞噬体进入细胞质中生存和繁殖,引起巨噬细胞凋亡等重要生物学功能,同时HBHA作为特异性抗原,用作免疫学检测具有较好的效果,并且动物实验证实HBHA具有明确的免疫治疗作用。因此,HBHA在结核病的免疫学诊断及免疫治疗方面,具有广阔的应用前景。
- 江鹰赵善民师长宏
- 关键词：结核分枝杆菌HBHA生物学功能
- 结核分枝杆菌肝素结合血凝素蛋白的表达、纯化及免疫学特性的初步研究
- 2011年
- 目的:克隆肝素结合血凝素(HBHA)基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化,利用获得的蛋白进行免疫学特性的初步研究。方法:用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出HBHA基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pQE80L并在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。获得的蛋白免疫BALB/c小鼠,测定血清抗体水平及IgG2a/IgG1比例。结果:克隆了HBHA基因,并成功表达该蛋白,SDS-PAGE及Western-blot分析表明表达产物正确。通过亲和层析法得到28kD纯化蛋白,与文献报道相符,诱导小鼠可使CD4+和CD8+细胞数明显增加。结论:成功获得了纯化的HBHA蛋白,明确了HBHA蛋白的免疫学特性,为进一步研究HBHA蛋白的致病机理及新型疫苗的开发提供了实验依据。
- 江鹰赵勇张海毛峰峰张彩勤白冰师长宏
- 关键词：结核分枝杆菌HBHA纯化
