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杨艳坤: 作品数：62 被引量：124H指数：6; 供职机构：江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室更多>>; 发文基金：国家自然科学基金中央高校基本科研业务费专项资金国家重点基础研究发展计划更多>>; 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程农业科学更多>>

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恶臭假单胞菌F1表达P450酶催化柠檬烯生物合成紫苏醇: 2024年; 紫苏醇是一种天然存在的单萜类化合物,在医药、日化、食品等行业具有广阔应用前景,但利用柠檬烯生物合成中的过程中存在选择性不强、底物对宿主菌株有毒性等问题。为此该文选择恶臭假单胞菌F1这种对环境具有高耐受度的菌株,构建在大肠杆菌和恶臭假单胞菌中皆可扩增并表达目的基因的广宿主载体,过表达选择性羟化酶CymAa、CymAb,异源表达特异性氧化柠檬烯生成紫苏醇的P450酶CYP153A6,并在表达P450酶的基础上对柠檬烯底物添加浓度进行了调整,与大肠杆菌BL21(DE3)一同进行柠檬烯生物合成紫苏醇实验,并使用紫外可见分光光度计和GC-MS分别测量菌株生长状况和紫苏醇产量。最终证明了恶臭假单胞菌F1在柠檬烯浓度为10 mmol/L内的环境中具有高耐受度,且添加1 mmol/L柠檬烯底物发酵48 h后获得最高产量75.6 mg/L,最高转化率达到49.66%,缩小了生物合成紫苏醇的底物添加范围,并获得对柠檬烯具有高耐受度的发酵宿主。; 底心怡刘春立刘秀霞刘秀霞白仲虎; 关键词：细胞色素P450 恶臭假单胞菌萜类化合物

基于全基因组重测序策略对谷氨酸棒杆菌外源蛋白高产菌株相关基因的挖掘及初步验证: 2021年; 谷氨酸棒杆菌是食品安全级菌株,可作为生产高价值产物的优良底盘细胞用于工业生产。它具有良好的分泌系统,是表达重组蛋白的潜在宿主,有极大的研究价值。为优化底盘细胞提高其蛋白表达能力,挖掘并验证谷氨酸棒杆菌中与外源蛋白高表达相关的基因。在谷氨酸棒杆菌重测序的基础上,应用生物信息学对单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms,SNP)基因进行挖掘,分析基因保守结构域。通过构建SNP基因过表达和敲除重组菌株,评估其生长情况以及增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)和人重组特立帕肽(recombinant human teriparatide,rtPTH)的外源蛋白表达能力。分析并整理了高产量外源蛋白菌株的重测序数据,共有33个SNP突变位点,主要涉及5个基因。其中SNP重组菌株over-2370和ko-973-974的荧光值最高,并且发酵生产rtPTH,均比野生型(wild type,WT)提高了近1倍。该研究成功挖掘出与蛋白表达相关的基因GL002370和GL000974,这些发现将有助于获得优化的底盘细胞,并为深入研究增加蛋白产量的靶基因提供指导。; 孟丽虹刘秀霞杨艳坤杨艳坤; 关键词：谷氨酸棒杆菌

谷氨酸棒杆菌内源表达元件的筛选被引量：4: 2016年; 【目的】构建谷氨酸棒杆菌表达元件探测载体,筛选能够启动蛋白表达的序列片段。【方法】基于谷氨酸棒杆菌表达载体p XMJ19,利用Golden Gate新型克隆方法构建表达元件插入位点,使筛选的片段能够与报告基因快速无缝衔接,同时避免残留额外的序列对表达元件效果测试产生可能存在的干扰。对本课题组前期的谷氨酸棒杆菌BZH001高、中、低溶氧条件下的发酵样品转录组数据进行分析,筛选出稳定于高转录水平的6个基因,通过软件预测每个基因的启动子区域和5′UTR区域,两者构成能够启动基因表达的功能性元件,并将其从基因组中克隆出来。以增强型绿色荧光蛋白基因egfp作为报告基因,快速测量出表达元件的效果。【结果】获得5个不同效果的内源性表达元件,最好的元件插入探测载体后在谷氨酸棒杆菌中表达的荧光强度大于3 500 RFU/OD600。【结论】通过结合转录组数据,探测载体能够快速有效筛选表达元件,为将来人们对谷氨酸棒杆菌基因工程改造和生物系统的构建提供更多基础材料。; 刘秀霞赵子豪孙杨杨艳坤白仲虎; 关键词：谷氨酸棒杆菌 RNA-SEQ 启动子

生物过程工程研究在创新生物医药开发中应用的驱动力--生物反应器被引量：6: 2016年; 近年创新生物医药在生物产业中的比重逐渐增大,也给生物产业带来了巨大的经济效益,靶点筛选及分子构建等上游技术的进步是促进生物医药进步的主要原因。随着目前细胞培养技术在生物医药生产中的广泛应用,对细胞培养技术的要求也不断提高,同时细胞培养技术的实现载体——生物反应器的技术改进和创新也越发凸显其重要性。本文介绍了生物反应器在创新生物医药产业中的应用种类、发展趋势及发展驱动力,回顾了全球范围内新型生物反应器的发展成果,包括新型反应器技术及过程分析技术在生物医药中的应用,最后,分析了中国生物反应器的发展现状与问题,指出了生物反应器的发展与进步应以提高生物培养过程的稳定性最终提高产品的质量而不是以提高产量为主要目标。本文详细阐述现代生物反应器技术及基于"质量源于设计"的质量控制理念在其中所起到的关键作用,以及生物反应器的技术发展的现状和未来走向。; 孙杨聂简琪刘秀霞杨艳坤戴晓峰白仲虎; 关键词：生物反应器生物工程微反应器

Expi293F表达重组鲎C因子用于荧光法内毒素检测: 2024年; 鲎C因子是一种对痕量内毒素高度敏感的丝氨酸蛋白酶原,在医药行业可替代鲎试剂用于内毒素检测。然而其重组表达困难,且对于环境中内毒素的控制要求极高。该文首先克隆了来源于东方鲎的全长C因子,并在N末端和C末端分别添加了Flag标签和6×His标签,同时用哺乳细胞表达载体中的分泌信号肽替换掉了原始C因子信号肽。构建好的重组质粒转染至人胚胎肾脏细胞Expi293F悬浮培养7 d后收获上清液,Western Blot检测蛋白与预测大小128 kDa一致,具有与内毒素结合以及结合后切割荧光底物的能力。该研究首次在人胚胎肾脏细胞Expi293F中成功表达出具有生物学活性的全长C因子,表达量达到19.18 mg/L,比DING在昆虫细胞SF9中的表达量提高了113%。该方法对于后续开发低成本内毒素检测试剂盒具有指导意义。; 柯文锋李诗洁郑梦林白仲虎杨艳坤; 关键词：内毒素检测脂质体转染

基于异戊烯基焦磷酸异构酶的改造及表达优化提高异戊二烯产量: 2023年; 异戊二烯是最简单的萜烯类化合物,是橡胶、食品、医药和化妆品工业的重要原料。在微生物中构建甲羟戊酸(mevalonate,MVA)代谢途径是目前生产异戊二烯及其衍生萜烯的有效途径,但关键酶的活性和表达水平会限制异戊二烯的合成。针对关键酶-异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)的活性低等问题,该研究从酶工程、启动子工程和核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)工程3个方面对IDI的表达进行了优化。首先在大肠杆菌中建立了异戊二烯生产体系,挑选肺炎链球菌来源的IDI进行蛋白质建模和结构分析,计算得到了活性热点Met146并对其进行点突变。经过改造得到1株突变体Met146His,其将异戊二烯的产量提升至820.46 mg/L。接着针对该突变株进行启动子优化和RBS优化,最终得到的优化菌株将异戊二烯的产量提升至862.79 mg/L,是出发菌株的2.58倍。结果证明,对于IDI进行酶分子改造和表达优化以提高酶活性并调控表达水平,是提高异戊二烯产量的有效策略。IDI的优化也可以应用于异戊二烯的下游产物,如倍半萜和二萜等的生物合成。; 孙瓅刘春立刘秀霞刘秀霞杨艳坤白仲虎; 关键词：异戊二烯

科学研究前沿进展促进细胞生物学教学质量的提高被引量：2: 2016年; 当今生命科学迅速发展,细胞生物学是生命科学领域中的一个重要基础学科,它包含的内容和研究技术在不断更新中。教师有必要将科学研究前沿进展纳入细胞生物学的教学内容中,紧贴时代发展。本文概述了细胞生物学教学内容纳入科学研究前沿进展后在教学改革中的一些探讨。; 刘秀霞杨艳坤何东旭戴晓峰白仲虎; 关键词：细胞生物学教学改革

球形芽孢杆菌营养期杀蚊毒素特性及其遗传改良: 球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)是一种自然界中广泛分布的好气芽孢杆菌。由于其对蚊幼虫具有特异性毒杀作用，在世界范围内被成功地应用于疾病媒介蚊虫的生物防治中。<br>　　球形芽孢杆菌的...; 杨艳坤; 关键词：球形芽孢杆菌致倦库蚊定点突变蛋白酶水解生物防治

25-羟基维生素D化学发光检测试剂盒的研发被引量：7: 2017年; 研制了用于定量检测人血清中25-羟基维生素D(25-OHD)水平的化学发光法检测试剂盒,并对试剂盒各项性能指标进行验证。试剂盒建立的方法为:将25-OHD单克隆抗体包被于微孔板中,将血清样品与释放剂同时加入微孔板中进行孵育,使样品的25-OHD充分释放出来并与包被板上的25-OHD抗体相结合。再加入酶结合物(生物素化25-OHD和链霉亲和素化过氧化物酶(SA-HRP)的混合物),使之与25-OHD抗体相结合,形成竞争免疫复合物,随后洗涤除去未结合的物质,加入化学发光底物,使用化学发光免疫分析仪读取相对发光强度(RLU)。制备的25-OHD检测试剂盒最低检出限为4.9 ng/m L,准确度相对偏差在±10%以内,批内变异系数小于10%,批间变异系数小于15%,2℃~8℃存放有效期为1年。对200份临床血清样本进行检测,与参比试剂盒检测结果的相关系数R=0.9717。试剂盒各项性能指标均符合行业标准要求,具有灵敏,稳定,快速,简便等特点。; 宋翠翠李昕卢菲白仲虎杨艳坤; 关键词：25-羟基维生素D 化学发光法试剂盒

猪胸膜肺炎放线杆菌细胞毒素ApxⅡ在谷氨酸棒杆菌中的截短表达被引量：2: 2022年; 猪胸膜肺炎放线杆菌细胞毒素ApxⅡ(Actinobacillus.pleuropneumoniae toxin,Apx)作为亚单位疫苗可较好抵抗养猪业五大疾病之一的猪胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)。谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)是食品级安全微生物,疫苗蛋白表达潜力巨大。为实现重组ApxⅡ在谷氨酸棒杆菌中分泌表达,截取全长ApxⅡ中抗原表位序列获得ApxⅡ截短片段(ApxⅡ#5)并将其构建至谷氨酸棒杆菌表达载体pXMJ19中表达。为进一步提升ApxⅡ分泌表达水平,优化ApxⅡ表达盒中启动子和信号肽元件。结果表明,全长ApxⅡ未在谷氨酸棒杆菌中表达,截短ApxⅡ可在其中分泌表达。为进一步提高产量,通过启动子筛选,选用诱导型启动子tac,其表达强度为全合成启动子H36的1.58倍;通过信号肽筛选,选用CspB信号肽,其分泌表达强度为对照组CgR0949信号肽的5.48倍。在谷氨酸棒杆菌中表达截短ApxⅡ摇瓶水平产量达到51.1 mg·L^(-1),可与猪抗ApxⅡ阳性血清特异性免疫。研究结果可为兽用疫苗产业提供质量可靠、低成本表达体系。; 杨术杰孙曼曼刘秀霞刘秀霞白仲虎; 关键词：谷氨酸棒杆菌截短表达信号肽

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