陈永井
- 作品数：173 被引量：417H指数：11
- 供职机构：苏州大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划江苏省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学文化科学农业科学更多>>
- 血红素加氧酶1分子克隆及表达载体的构建
- 2009年
- 背景:近年来许多研究发现血红素加氧酶1具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用,并且在心肌缺血-再灌注损伤等应激反应中有重要的保护作用,从而成为研究热点。目的:克隆大鼠血红素加氧酶1全长基因,并将其于真核表达载体PIRES2-EGFP相连接,构建血红素加氧酶1的真核表达载体。设计、时间及地点:实验于2008-03/06在苏州大学生物技术研究所完成。材料:成年雄性SD大鼠,由苏州大学动物实验中心提供,用于脾脏细胞总RNA的提取;克隆载体PMD18-T购自Takara公司;表达载体PIRES2-EGFP由苏州大学生物技术研究所保存。方法:分离大鼠脾脏获取脾脏细胞,Trizol法提取脾脏细胞的总RNA,经反转录-聚合酶链反应扩增获得血红素加氧酶1基因,将扩增出来的产物与克隆载体PMD18-T连接,转化TOP10感受态细菌,挑取阳性克隆经PCR及酶切鉴定后测序确证。测序正确后抽提质粒作为模板进行PCR,Sal-Ⅰ和BamH-Ⅰ同时双酶切PCR产物和载体PIRES2-EGFP,再在T4DNA连接酶的作用下进行连接,构建其真核表达载体。主要观察指标:血红素加氧酶1基因的克隆和DNA测序结果证实序列是否正确;PIRES2-EGFP/血红素加氧酶1真核表达载体的构建以及测序证实目的基因成功插入载体。结果:①实验完成了大鼠血红素加氧酶1基因的克隆,所获得的序列与GeneBank中收录的大鼠血红素加氧酶1序列完全一致。②构建真核表达载体PIRES2-EGFP/血红素加氧酶1,测序正确说明血红素加氧酶1基因成功插入表达载体PIRES2-EGFP中。结论:实验成功克隆了大鼠血红素加氧酶1基因全长,并构建了其真核表达载体。
- 张燕王如兴李肖蓉陈永井杨丽华党时鹏王明元张学光
- 关键词：血红素加氧酶1克隆
- 协同刺激分子B7-H3在重症肌无力患者外周血中的表达被引量：5
- 2012年
- 目的:检测重症肌无力(MG)患者外周血中协同刺激分子B7-H3的表达,并探讨其临床意义。方法:收集35例MG患者和44例健康对照(HC)外周血标本,采用免疫荧光标记,流式细胞检测外周血单个核细胞模型B7-H3(mB7-H3)的表达,ELISA法检测MG和HC血浆中可溶性B7-H3(sB7-H3)的含量。结果:MG患者外周血T淋巴细胞、单核细胞和B淋巴细胞上mB7-H3低水平表达,与HC无差异;MG患者外周血sB7-H3浓度为(2.166±0.958)ng/mL,显著低于HC(3.379±0.768)ng/mL;全身型MG(GMG)sB7-H3的浓度为(1.664±0.699)ng/mL,低于眼肌型MG(OMG)(2.396±0.985)ng/mL;并发胸腺异常的MG sB7-H3浓度为(1.593±0.441)ng/mL,低于胸腺正常MG(2.364±1.014)ng/mL;MGsB7-H3含量与QMGS评分呈负相关(r=-0.4189,P=0.012);免疫细胞mB7-H3与血浆sB7-H3无相关性。结论:MG患者sB7-H3表达下调,与疾病严重程度相关;在不同病理类型MG患者体内存在差异性表达,提示该分子可能参与了MG的免疫病理进程。
- 蒋觉安薛群刘翠平高犁张光波陈永井张学光
- 关键词：重症肌无力B7-H3自身反应性T细胞免疫调控
- 人源化抗体构建过程中假链的产生及应对策略被引量：1
- 2006年
- 目的在人源化抗体构建过程中,采用方便、快捷的分子克隆手段,消除SP2/0内源性畸形轻链转录本以获得正确的轻链cDNA。方法在mRNA抽提时,不用常规的TRIZOL法抽提总RNA,而采用经腹腔培养,生长状态良好的杂交瘤细胞,用QIAGEN公司Oligotex Direct mRNA Purification Kit,将polyA+的mRNA富集。可有效减少畸变转录本的含量,提高功能型mRNA的丰度。利用polyA+RNA,采用RT-PCR,我们成功地克隆到了轻链可变区序列,序列分析证实读码框完全正确,属于轻链可变区基因。结果NCBI数据库BLAST显示,克隆的基因序列符合小鼠Ig可变区特征,具有正确的CDR和FR功能区及VJ连接区。结论采用polyA+mRNA富集技术,成功克隆获得阻断型抗人CD154 mAb(4F1)单克隆抗体的轻链、重链可变区基因,成功地消除了SP2/0内源性畸形转录本对免疫球蛋白功能性轻链基因的影响。
- 葛彦陈永井张学光
- 关键词：假基因杂交瘤
- CD80鼠-人嵌合抗体的CHO细胞表达及体外生物学功能的初步研究被引量：12
- 2009年
- 目的:CHO细胞表达抗人CD80鼠-人嵌合抗体ch4E5,并研究其在体外阻断CD80介导的共刺激信号转导的生物学功能。方法:构建含有嵌合重、轻链基因的表达载体pIRES/ch4E5;表达载体先转染293T细胞,FCM检测到ch4E5抗体的瞬时表达后,表达载体再转染CHO细胞,构建稳定表达细胞株CHO-ch4E5;ProteinG亲和层析法从CHO-ch4E5细胞无血清培养上清中纯化ch4E5抗体,FCM检测ch4E5抗体对膜型CD80的识别;以丝裂霉素处理的正常人外周血单核细胞PBMCs为刺激细胞,以异体正常人外周血淋巴细胞PBLs为反应细胞,用MTT法分析ch4E5抗体的阻断作用。结果:ch4E5抗体在293T细胞的瞬时表达于48小时达到高峰,上清与L929-B7-1细胞结合率为96.0%;CHO-ch4E5细胞持续表达ch4E5抗体,其培养上清与L929-B7-1细胞结合率为95.7%;3天培养上清中,ch4E5抗体的产率约为5.56mg/L;ch4E5抗体和L929-B7-1、Daudi、Sub-T细胞结合率分别为94.1%、25.7%、23.5%;ch4E5抗体可以阻断CD80介导的共刺激信号转导,抑制异体PBLs的体外增殖。结论:在CHO细胞中成功表达了抗人CD80鼠-人嵌合抗体ch4E5,在体外该嵌合抗体具有亲本抗体阻断CD80介导的共刺激信号的生物学活性。
- 徐耀瑜胡玲玲陈永井程钢罗先富孙杰刘玉华王艳茹陈明心邱玉华
- 关键词：CD80嵌合抗体阻断作用
- 复发性生殖器疱疹患者血清可溶性PD-1的表达和免疫学意义被引量：2
- 2011年
- 目的检测复发性生殖器疱疹（RGH）患者血清中可溶性PD-1（sPD-1）蛋白的浓度，探讨sPD-1的异常表达在HSV-Ⅱ病毒感染中的意义。方法选择74例RGH患者，其中发作期RGH患者34例，稳定期RGH患者40例，同时选择88例健康献血者作为对照组；应用单克隆抗体标记、ELISA法检测sPD一1的表达情况。结果RGH组血清sPD-1蛋白水平为（33．06±17．5）μg，L，低于对照组sPD-1水平（53．07±26.3）μg/L，两者比较差异有统计学意义（t=5．78，P〈0．01）。发作期RGH组血清sPD-1蛋白水平为（27．47±12．9）μg／L，稳定期RGH组为（37．71±19．6）μg/L，两组间差异有统计学意义（P〈0．01）。结论RGH组血清中sPD-1异常低表达，可能是HSV—Ⅱ逃避机体免疫监视、产生免疫耐受的机制之一。
- 吴健贾国泉吴瑞斌胥萍陈永井吴敏智张逸成张学光
- 关键词：复发性生殖器疱疹SPD-1血清可溶性免疫学ELISA法
- 利用家蚕-HyNPV表达系统表达鼠抗人CD28分子单链抗体被引量：2
- 2009年
- 人CD28分子是T细胞表面的最重要的协同刺激分子。将抗人CD28的鼠源单链抗体基因(mouse anti-human CD28-ScFv)亚克隆至杂交病毒HyNPV Bac-to-Bac系统供体质粒pFastBacHTa中,获得重组转移载体pFast-BacHTa CD28-ScFv,并转化大肠杆菌(E.coli)DH10Bac获得重组杆粒rBacmid CD28-ScFv,脂质体介导转染Sf9昆虫细胞后获得重组杆状病毒rBV CD28-ScFv。该重组杆状病毒注射接种于家蚕5龄起蚕,经SDS-PAGE和Westernblotting分析表明,CD28-ScFv在家蚕体内得到了表达,即:人CD28单链抗体通过HyNPV这一宿主范围扩大的新型杂交杆状病毒表达载体在家蚕中获得了表达。
- 黄光镁邱玉华陈永井郑小坚吴小锋胡静平朱江
- 关键词：家蚕生物反应器单链抗体
- 原发性干燥综合征患者血清可溶性PD-L1的表达及临床意义
- <正>目的原发性干燥综合征(pSS)是一种主要累及外分泌腺体尤以唾液腺和泪腺为主的自身免疫性疾病,发病机制极为复杂,目前尚未研究清楚。研究发现PD-1/PD-L1共刺激信号的异常可能与pSS的免疫病理损伤密切相关。本研究...
- 张学光胡筱涵刘翠平陈永井武剑
- 文献传递
- 抗人OX40L单克隆抗体制备及应用
- 本发明涉及肿瘤坏死因子超家族成员的结合蛋白质或多肽，更具体地说，本发明涉及抗人OX40L单克隆抗体9H10、4C12和1E7，其制备方法以及这些单克隆抗体在抑制混合淋巴细胞反应、刺激T细胞增殖、诱导树突状细胞分化成熟、刺...
- 张学光王勤陈永井施勤
- 文献传递
- 一种治疗炎症性肠病的细胞药物
- 本发明涉及一种治疗炎症性肠病的细胞药物，通过用琥珀酸盐处理经炎症因子刺激后的间充质干细胞得到。本发明通过使用琥珀酸盐体外预处理间充质干细胞，提升MSCs胞内HIF‑1α的蛋白水平，增强细胞的糖酵解能力，提高免疫抑制因子的...
- 时玉舫房建凯邵常顺陈永井
- 人可溶性OX40L蛋白ELISA检测试剂盒的研制及其在自身免疫性疾病诊断中的应用被引量：2
- 2010年
- 目的研制特异性检测人可溶性OX40L蛋白(sOX40L)的ELISA试剂盒,探讨其在自身免疫性疾病临床诊断中的应用。方法利用两株识别不同抗原表位的鼠抗人OX40L单克隆抗体1G1和4C12分别作为包被抗体和检测抗体,采用双抗体酶联免疫夹心法研制特异性检测人sOX40L的ELISA方法,并对其稳定性、精确性和特异性进行分析。结果①建立的检测人sOX40L酶联免疫试剂盒在抗原浓度为3.91～250ng/ml范围内有良好的线性关系,并具有良好的稳定性、较高的准确性和特异性。②利用该ELISA方法检测到sOX40L蛋白在肾病综合征和Graves’病患者血清中表达水平均显著高于健康对照组。结论成功建立了检测人sOX40L蛋白的ELISA试剂盒,应用该方法检测到sOX40L在多种自身免疫病患者血清中异常高表达。该试剂盒在OX40L分子基础研究以及自身免疫病的临床诊断方面具有潜在的应用价值。
- 王勤谢芳陈永井陈蕾李晓忠王雪峰张学光
- 关键词：协同刺激分子OX40L酶联免疫吸附测定自身免疫性疾病
