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一种pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒及其构建方法和应用: 本发明属生物技术领域，具体为一种质粒pCMV‑RBE‑TK1‑N2‑EF1α‑hFIXml及其构建方法和应用。该质粒含CMV启动子‑RBE元件‑TK1基因的筛选标记的人凝血因子IX表达框架。该质粒和rep表达质粒共转染哺...; 陈金中阮婕沈琦薛京伦; 文献传递

CD19基因过表达K562细胞株及NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型的建立: 2015年; 目的建立人CD19基因过表达的K562细胞株（CD19．K562）NOD．SCID小鼠皮下移植瘤模型。方法克隆人CD19基因构建MigRl-CD19反转录病毒载体，转入Plat—A包装细胞，病毒上清转染K562细胞，反转录聚合酶链反应（PCR）及流式细胞术检测转染细胞CD19基因和蛋白表达，体外反复传代获得CD19-K562稳定转染细胞株，锥虫蓝染色，细胞计数检测细胞增殖，AnnexinV／碘化丙啶（PI）双染流式细胞术检测细胞凋亡。CD19．K562细胞株皮下接种NOD-SCID小鼠并经体内外传代后建立移植瘤亚系CD19．K562-a，建立NOD—SCID小鼠皮下移植瘤模型。应用反转录PCR、瑞特染色、免疫组织化学等方法验证CD19．K562-a细胞性质。结果成功建立了人CD19．K562细胞稳定株，CD19阳性率（99．80±0．17）％。CD19-K562细胞增殖、凋亡未受转染及传代影响。CD19-K562细胞稳定株皮下接种NOD．SCID小鼠后经体外结合体内传代建立移植瘤亚系CD19-K562-a，其CD19阳性率为（99．78±0．04）％，CD19-K562．a和CD19．K562细胞均呈未分化形态。CD19．K562-a皮下接种NOD．SCID小鼠成功建立移植瘤模型，CD19．K562-a瘤体CD19基因表达强阳性。结论通过构建MigR1-CD19重组载体获得CD19基因过表达的K562稳定转染细胞株（CD19．K562），同时采用体外结合体内传代建立稳定成瘤的NOD．SCID小鼠移植瘤亚系CD19-K562．a并成功建立NOD—SCID小鼠皮下移植瘤模型。; 王扬程辉陈科婷何妙侠阮婕唐古生杨建民; 关键词：K562细胞异种移植模型

利用MigR1质粒构建CD19-CAR逆转录病毒载体优化其对人原代T细胞的转染效率被引量：3: 2015年; 目的优化二代CD19嵌合抗原受体（CD19-CAR）逆转录病毒载体对人原代T细胞的转染效率。方法应用重组DNA技术将CD19．CAR构建人逆转录病毒载体，转入plat-A包装细胞收集病毒上清并转染人原代T细胞及K562细胞系，采用流式细胞术检测不同条件下的转染效率，用RT-PCR方法检测目的基因的表达情况，用ELISA法检测IFN-γ、TNF-α表达水平。结果①MigR1-CD19-CAR逆转录病毒载体成功构建后包装高滴度逆转率病毒；②相同条件下，MigR1-CD19-CAR逆转录病毒对K562细胞系转染效率显著高于T细胞；③对T细胞，离心120min组的转染率为（54．5±14．6）％，明显高于未离心组、离心30min组及离心60min组（P值均〈0．05）；④CD3／CD28磁珠与rhIL-2联合对人T细胞活化扩增效率个体差异显著，根据扩增倍数优化个体转染时机可提高转染效率（最高达69．3％），且RT-PCR检测证实CD19．CAR目的基因在转染后72hT细胞中高效特异性转录；⑤CD19-CAR-T细胞与CD19．K562细胞共培养组IFN-γ、TNF-α表达水平均增加，分别为（13230±1543）pg／ml、（4217±211）pg／ml，与阴性对照组比较差异均有统计学意义（P值均〈0．01）。结论通过MigR1-CD19-CAR逆转录病毒载体转染人原代T细胞，并通过延长离心转染时间、根据扩增倍数确定个体转染时机而成功优化转染效率，RT-PCR检测CD19-CAR目的基因在转染后人T细胞中高效特异性转录，CD19-CAR-T细胞特异性识别靶细胞引发IFN-γ、TNF-α表达水平增加。; 王扬唐古生徐丽丽阮婕程辉周虹华亦斐胡晓霞顾海慧钱宝华王健民杨建民; 关键词：质粒转染细胞因子类

hFIX双筛选定点整合系统的研究及两个整合相关蛋白的初步探索: 第一部分 hFⅨ双筛选定点整合系统的研究　　血友病B(hemophilia B)是人凝血Ⅸ因子(human clotting factorⅨ，hFⅨ)缺乏所引起的一种出血性疾病。基因治疗是遗传型疾病根本的治疗方法。然而遗...; 阮婕; 关键词：血友病B 基因治疗; 文献传递

一种pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒及其构建方法和应用: 本发明属生物技术领域，具体为一种质粒pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml及其构建方法和应用。该质粒含CMV启动子-RBE元件-TK1基因的筛选标记的人凝血因子IX表达框架。该质粒和rep表达质粒共转染哺...; 陈金中阮婕沈琦薛京伦; 文献传递

D-box附近泛素化位点突变对Cdc20介导的Sp100蛋白降解的影响被引量：1: 2015年; 前期的研究发现Cdc20介导Sp100通过泛素-蛋白酶体途径降解,Sp100中的D-box在底物识别过程中具有重要作用.尽管在PML和DAXX中都存在典型的D-box序列,但是这两种蛋白都不能被Cdc20所识别.本研究中,我们构建了一系列含D-box的Sp100截断体来探讨Cdc20底物识别的必要序列.研究发现GFP-Sp100(152-182)截断体包含D-box但是不能被APC/C-Cdc20降解.GFP-Sp100(151K→G)突变潜在泛素结合位点后,Sp100降解显著受到抑制.远离D-box的潜在泛素化位点(217K,219K,225K)破坏后对Sp100降解没有影响.我们的结果表明,Sp100蛋白中D-box附近泛素化位点(151K)在Cdc20介导的蛋白降解中是必要的.; 阮婕王然李一忱沈琦薛京伦陈金中; 关键词：SP100

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阮婕

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