王刚
- 作品数：24 被引量：64H指数：6
- 供职机构：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所更多>>
- 发文基金：病毒基因工程国家重点实验室开放课题基金国家科技重大专项艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- rhIFN-β1a cDNA在CHO细胞上的表达
- 2004年
- 目的 在CHO细胞上表达rhIFN βcDNA。 方法 利用脂质体技术 ,将含hIFN β基因的pRC CMV IFNβ DNA载体和pSV2dhfr DNA质粒按 3∶1的比例转染CHO k1dhfr 细胞 ,后者是选择性标记。筛选在缺乏胸腺嘧啶的选择培养基生长的单个细胞克隆 ,通过MTX加压扩增与dhfr基因共转染IFNβ基因。筛选的细胞株通过大规模培养 ,收集培养液经一系列的步骤纯化。结果 能够耐受 0 .6 μmol LMTX的细胞可产生IFN 10 5unitperday 10 6cells ,CHO细胞中表达的hIFN β纯化后的抗病毒比活性可达 2 .2× 10 8IU mg。结论 建立了适合表达人干扰素
- 李武平衣作安张成海王刚郑丽舒段招军吕宏亮侯云德
- 关键词：干扰素卵巢细胞
- 幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因(ureI)的克隆及其表达和纯化被引量：1
- 2004年
- 目的 对幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因ureI进行克隆、测序 ,并在昆虫细胞中表达及进行产物纯化。方法 克隆ureI基因 ,经测序正确后 ,酶切、连接到pFASTBACHb质粒上 ,与穿梭载体DH10BAC转座 ,获得Bacmid ureI质粒 ,转染Sf9细胞 ,采用Ni2 +螯合琼脂糖亲和层析纯化 ,经SDS PAGE和Westernblot鉴定。结果 克隆了ureI基因 ,并在昆虫细胞Sf9中表达纯化 ,蛋白纯度达 85 %以上 ,并与 6 His单抗特异结合。
- 衣作安李武平张成海高建梅王刚段招军侯云德
- 关键词：幽门螺杆菌基因克隆昆虫细胞纯化
- microRNA-122调控的自杀基因治疗肝癌的研究
- 肝细胞癌(简称肝癌)是最为常见的肝脏原发性恶性病变。由于传统的治疗手段如手术切除、肝移植和化疗的治疗效果不理想,迫切需要研究和发展新的治疗方法。腺病毒(Ad)介导的胸苷激酶/更昔洛韦(TK/GCV)自杀基因治疗是有临床应...
- 王刚
- 关键词：胸苷激酶腺病毒自杀基因治疗
- 文献传递
- 用重组8型腺相关病毒载体介导的乙型肝炎病毒持续感染小鼠模型评价核苷类似物的抗病毒效果被引量：12
- 2013年
- 探索用重组8型腺相关病毒载体携带1.3拷贝乙型肝炎病毒(rAAV8-1.3HBV)介导的HBV持续感染小鼠模型评价核苷酸类似物抗病毒药物的抗病毒效果。首先,通过将rAAV8-1.3HBV经尾静脉注射到30只C57BL/6小鼠体内,建立HBV持续感染模型并对模型成功率进行检测,将建模成功的27只小鼠随机分成6组。然后采取灌胃的方式给予不同剂量的抗病毒药物恩替卡韦(ETV)及拉米夫定(LAM),每日1次,连续10 d,后停药15 d,同时设置生理盐水及空白对照组。其中ETV分为高剂量(1.0 mg/(kg d))和低剂量(0.1 mg/(kg d))两组;LAM分为高剂量(500 mg/(kg d))和低剂量(100 mg/(kg d))两组。检测给药前后和停药前后小鼠模型血清中HBV DNA、HBeAg和HBsAg表达水平并比较变化情况。结果发现连续给药10 d后,各给药组与生理盐水组相比,血清中HBV DNA水平均显著下降,具有统计学差异(P<0.05)。停药15 d后,低剂量的ETV与LAM两组血清HBV DNA水平出现反弹,差异存在统计学意义(P<0.05)。在整个实验过程中,各组小鼠血清中HBeAg和HBsAg表达水平均未出现明显变化。上述结果表明,ETV和LAM能有效抑制模型小鼠中HBV病毒的复制,而对HBeAg和HBsAg表达水平无明显影响;提示AAV8-1.3HBV介导的HBV持续感染小鼠模型制备简单,成模率高,可有效体现出ETV和LAM抗HBV的作用效果,从而用于核苷酸类似物抗HBV药物的筛查。
- 王国婧王刚董小岩田文洪尉迟捷魏国超孟红吴小兵
- 关键词：核苷酸类似物药物评价
- 双萤光素酶共表达载体构建及特性研究被引量：4
- 2010年
- 利用来源于TaV的自剪切多肽2A的编码序列构建一种分泌型萤光素酶Gluc和非分泌型萤光素酶Fluc共表达的载体,对其体内外表达及活体成像特点进行研究。采用重叠PCR技术获得Gluc-2A-Fluc片段,克隆入表达质粒pAAV2neoCAG中,获得重组质粒pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc。将重组质粒瞬时转染BHK-21细胞,24h后在细胞上清液和细胞裂解液中均能检测到Gluc和Fluc的表达,其中Gluc98%以上分布在上清液中,而Fluc98%以上存在于细胞中,随时间延长Gluc活性在上清液中逐步增加,而细胞内Fluc活性则保持相对平稳。用水动力法经小鼠尾静脉注射pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc质粒DNA,通过尾静脉微量采血(2.5μl/次)即可实时地监测体内Gluc的表达情况。活体成像结果显示,注射Gluc的底物腔肠素时小鼠明显表现为全身显像,显像在10min内迅速衰减;而注射Fluc的底物D-Luciferin时显像主要集中在肝脏,显像在30min内都比较稳定。本研究设计和构建的pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc质粒实现了分泌型和非分泌型萤光素酶的共表达,既可以在不裂解细胞或处死动物的情况下直接在细胞培养上清或血液中动态检测Gluc的活性,又可以利用活体成像技术准确定位Fluc表达部位,比单一的萤光素酶报告载体在细胞标记和体内示踪研究方面更具优越性。
- 付昕阳王刚田文洪陈素云董小岩吴小兵谭万龙
- 关键词：共表达
- 重组8型腺相关病毒介导双荧光素酶基因在小鼠体内的表达被引量：1
- 2012年
- 目的利用共表达的分泌型荧光素酶Gluc（gaussiaprincepsluciferase）和非分泌型荧光素酶Fluc（fireflyluciferase）研究重组8型腺相关病毒（recombinantadeno—associatedvirustype8，rAAV8）介导的转基因在小鼠体内的表达特点。方法制备携带双荧光素酶基因的重组8型腺相关病毒rAAV8－Gluc／Fluc，体外感染HEK293细胞并检测上清和胞内Gluc和Fluc活性；将不同剂量的rAAV8－Gluc／Fluc尾静脉注射或肌内注射至BALB／c小鼠，通过尾静脉采血检测Gluc活性，通过活体成像和裂解组织检测Fluc活性。结果成功制备了rAAV8－Gluc／Fluc，可以有效感染HEK293细胞，同时分泌表达Gluc和胞内表达Fluc；尾静脉注射或肌内注射rAAV8．Gluc／Fluc至小鼠后，外周血Gluc活性均在注射后10—20d达到高峰并稳定持续120d以上，Gluc活性随注射剂量增加而增高；静脉注射rAAV8-Gluc／Fluc时Fluc主要在肝脏表达，在骨骼肌和心肌有少量表达，而肌内注射时Fluc既在肌内注射局部表达同时也在肝脏中表达。结论本研究成功制备了携带双荧光素酶基因rAAV8－Gluc／Fluc，研究了其介导的转基因在小鼠体内的表达特点，为rAAV8的临床前应用打下基础。
- 王刚尉迟捷董小岩田文洪吴小兵
- 关键词：依赖病毒荧光素酶
- 体外实时动态监测水动力注射分泌型荧光素酶基因的表达被引量：6
- 2009年
- 为了建立体外实时动态监测转导基因的体内表达,本研究选择分泌型的荧光素酶基因Gluc作为报告基因,对其体内外表达特性和检测方法进行了研究。首先构建了Gluc表达质粒pAAV2neo-Gluc。将pAAV2neo-Gluc转染体外培养的Huh7、HepG2细胞后,细胞培养上清和细胞裂解液中分别检测到Gluc的活性,而上清比细胞中的含量高约100倍。表明表达的Gluc以分泌形式为主。用水动力法经小鼠尾静脉注射pAAV2neo-Gluc质粒,活体成像表明Gluc在小鼠体内呈全身分布,而注射了萤火虫荧光素酶质粒pAAV2neo-Fluc的对照小鼠则主要在肝脏显像。将剂量分别为0.1、1、10、50μg每只的pAAV2neo-GlucDNA用水动力法尾静脉注射小鼠,不同时间点连续尾静脉采血测定其中的Gluc酶活性,观察其Gluc体内表达和分泌的动态变化。结果显示,各剂量组的Gluc表达变化规律高度一致:注射后2h即可检测到Gluc表达,10h后达到高峰,之后逐渐下降;Gluc的表达水平与注射质粒DNA的量呈正相关;为了进一步观察Gluc检测的灵敏性,本研究又比较了注射更低的质粒剂量(包括0.001、0.01和0.1μg每只)时Gluc体内表达情况。结果发现注射剂量低至0.001μg每只小鼠都能在血中检测到Gluc表达,这一结果提示了Gluc检测的高度灵敏性。本研究首次报道了以Gluc为报告基因体外实时动态监测水动力注射基因的表达规律,为动态分析水动力注射基因的体内表达调控及功能研究提供了新的有效手段。
- 田文洪王刚罗顺涛董小岩付昕阳谭文杰吴小兵
- 关键词：基因表达EXVIVO
- 一种利用分泌型荧光素酶基因表达变化监测活细胞中miRNA活性的新方法
- 2010年
- 建立了一种以分泌型的荧光素酶Gluc为报告基因的miRNA传感器质粒（命名为Gsensor）监测活细胞中miRNA（microRNA）活性的方法。首先构建了pAAV2neo-Gluc-MCS-polyA质粒作为Gsensor的空载体,同时其中的MCS位点可供插入miRNA的靶序列。以miR142-3p为检测对象,将1个和3个拷贝的与miR142-3p完全互补靶序列分别插入pAAV2neo-Gluc-MCS-polyA中,构建成miR142-3p Gsensor和miR142-3p Gsensor-3。将它们分别转染至U937细胞中,检测培养上清中Gluc的表达水平。结果显示二者均可有效反映U937细胞中miR142-3p的抑制活性（分别与Gsensor空载体相比）,提示Gsensor中采用一个拷贝的miRNA靶序列即可满足检测要求。并且miR142-3p Gsensor也能有效地反映出Anti-miR142对miR142-3p活性的抑制作用。随后,分析了时间、转染剂量对Gsensor检测结果的影响。结果表明,在U937细胞中miR142-3p Gsensor表现的miR142-3p活性在48h后趋于稳定;Gsensor转染剂量在0.001~0.05pg/cell范围内不影响其功能。最后,利用miR142-3p Gsensor检测了HEK293、U937、K562、SP2/0和P815细胞内miR142-3p活性,结果发现miR142-3p活性在U937、K562、SP2/0和P815细胞中均较高,而在HEK293中几乎没有活性。用QRT-PCR方法检测miR142-3p的相对拷贝数。结果表明,在HEK293、U937和K562细胞中,miR142-3p活性与其相对拷贝数呈正相关。本研究表明Gsensor可作为一种有效的miRNA活性检测工具,为体外实时动态监测miRNA活性提供了一种新方法。
- 田文洪董小岩王刚吴小兵
- 关键词：MIRNA
- 笼型蛋白仿生纳米结构构建及抗病毒研究
- 2023年
- 本研究利用笼型铁蛋白亚基的解聚和自组装过程,在蛋白酶促活性位点上仿生合成1~3 nm尺径可控的金纳米团簇,构建了新型高生物活性抗病毒纳米药物Au@HFn,使用多种电镜学方法对其形貌、结构进行了表征;在抗病毒功效方面,Au@HFn具有抑制HepG 2.2.15细胞HBV s/e抗原分泌和降低HBV核酸复制的效果,抑制效果随金团簇尺径增加而提高并与纳米药物的浓度呈正相关;在细胞毒性实验测试中,Au@HFn未发现有细胞毒性,且增高了细胞活力,具有很高的生物安全性。本研究提出了一种新的抗病毒纳米药物构建策略,相对传统小分子抗病毒药物,在提高药物生物兼容性、降低毒副作用和抗耐药性等方面具有较大的潜力和应用前景。
- 袁嫕王超郭琼王刚谢志萍段招军郑丽舒
- 关键词：仿生合成抗病毒
- 携带乙型肝炎病毒感染性克隆的四种转基因载体在体内外抗原表达分析
- 2012年
- 目的构建四种不同结构的1．3倍全基因乙型肝炎病毒（HBV）转基因载体，观察HBV抗原在体内外表达水平的差异。方法克隆1．3倍的HBV基因至慢病毒转基因质粒pCS—CG并取代其中的EGFP表达盒，构建四种结构的pCS—HBVl．3质粒，体外转染Huh7细胞和尾静脉高压水动力法注射C57 BL／6小鼠后，ELISA方法分别检测细胞上清和小鼠血清中HBsAg和HBeAg的表达。结果成功构建了四种不同结构的pCS—HBV1．3质粒，四种质粒HBVS抗原与e抗原在体内外的表达趋势一致，即乙肝抗原表达水平在正向插入的转基因质粒中高于反向插入；HBV抗原表达水平还与载体序列中RRE调控元件和cPPT调控元件前的基因序列长度有关。结论筛选获得了可在体内外高效表达HBV抗原的转基因载体可应用于乙肝病毒体内外感染模型的建立与应用。
- 揣侠陈红杨扬王文文波王刚黄保英邓瑶谭文杰
- 关键词：基因组
