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禽流感病毒H5N1全基因组克隆与分析被引量：2: 2010年; 为明确广东地区分离的一株禽流感病毒H5N1的遗传背景,建立流感病毒反向遗传的平台。对该株禽流感病毒进行了空斑纯化与组织细胞培养,检测其在MDCK细胞中的增殖特性;利用H5N1病毒通用引物,通过RT-PCR对该病毒全基因组的8条片段进行全长克隆及测序分析;将H5N1的8条全长基因组片段分别插入反向遗传通用载体中,构建禽流感病毒H5N1的感染性克隆。结果表明,该H5N1毒株在MDCK细胞中可不依赖胰酶进行有效增殖与复制,可使MDCK细胞出现典型细胞病变,具有高致病性禽流感病毒的细胞增殖特征。RT-PCR克隆得到该H5N1毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS八条全长片段,经测序分析确认该毒株的基因序列,其内部编码序列出现多处突变,其中HA连接肽为多个连续碱性氨基酸,表明该毒株可不依赖胰酶进行有效复制,与细胞培养结果一致,未出现抗药性的遗传突变。PCR与测序证明,插入H5N1八个全长基因组片段的载体序列完全正确,表明成功构建了该毒株的感染性克隆。为明确病毒遗传信息,建立流感病毒反向遗传的平台,为进一步研究禽流感病毒相关疫苗提供了研究基础。; 王革非李卫中张衡曾俊陈幼莹陈小璇李康生; 关键词：流感病毒 H5N1 克隆

一种抗病毒蛋白质及其应用: 一种抗病毒蛋白质，其特征在于它是融合蛋白质，包含穿膜肽结构域和至少二个来源于APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶结构域，穿膜肽结构域和各胞嘧啶脱氨酶结构域形成串联体。本发明抗病毒蛋白质中，穿膜肽结构域使抗病毒蛋白质具有穿膜能力...; 李卫中李康生王革非辛岗苏芸陈小璇陈幼莹张衡张丹桂曾俊; 文献传递

人甲型H1N1流行性感冒病毒全基因组分析与反向遗传载体的克隆被引量：2: 2009年; 目的明确一株人甲型H1N1流行性感冒（流感）病毒的遗传背景，建立流感病毒反向遗传的平台。方法对分离自汕头市儿童的一株人甲型H1N1流感病毒进行空斑纯化；利用甲型流感病毒通用引物，对该病毒全基因组的8条片段（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS）进行RT-PCR全长克隆、DNA测序及初步生物信息学分析；将其8条全长基因组片段分别插入反向遗传通用载体，构建人甲型H1N1流感病毒的反向遗传系统。结果RT-PCR克隆得到该H1N1毒株的8条全长片段，经测序分析确认该毒株的基因序列，该毒株与2006年至2008年分离的人甲型H1N1流感病毒具有很高的同源性，未出现奥司他韦或金刚乙胺抗药性的遗传突变。PCR与测序证实，插入该菌株8个全长基因组片段的载体序列完全正确。结论成功构建了该毒株的感染性克隆。获得了该毒株全基因组序列，为明确病毒遗传信息、提供流行病学监测数据、建立流感病毒反向遗传平台奠定了研究基础。; 王革非张衡李卫中曾俊张丹桂陈幼莹陈小璇李康生; 关键词：流感病毒A型 H1N1亚型克隆遗传学技术基因组病毒

负链RNA病毒反向遗传通用载体的构建与鉴定: 2010年; 目的:用于负链RNA病毒的重组技术称为反向遗传技术,其核心需要构建一个具有双向启动子的反向遗传通用载体,可以分别正向转录翻译病毒复制所需酶系和负向转录病毒负链RNA。为此,构建负链RNA病毒反向遗传通用的载体。方法:为提高转染和表达效率,首先改造pcDNA3载体,通过酶切删除pcDNA3载体中非必需序列,在保留Amp抗性的前提下,通过酶切去除pcDNA3载体中非必需的Kan抗性表达盒与CMV启动子前区。利用长引物合成含有反向polI启动子与多克隆位点的基因片段。将合成后的片段酶切、补平粘端、连接,反向插入至经改造后的pcDNA3载体中,构建反向遗传通用表达载体。采用PCR检测、酶切鉴定以及DNA测序进行验证。结果:PCR检测、酶切鉴定以及DNA测序结果表明,载体构建正确,合成及插入序列与预期设计完全一致。结论:成功构建具有CMV与polI双向启动子的反向遗传通用载体,为建立负链RNA病毒反向遗传平台提供了研究基础。; 王革非张驰曾祥兴张衡陈幼莹李卫中李康生; 关键词：RNA病毒

流感病毒H1N1和H5N1感染小鼠小胶质细胞与星形胶质细胞诱导趋化因子转录水平上调被引量：6: 2010年; 目的:探讨胶质细胞感染流感病毒后的天然免疫反应,检测流感病毒H1N1和H5N1体外感染小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞,是否会诱导胶质细胞趋化因子转录水平的变化及其规律。方法:从新生小鼠大脑皮质分离培养神经胶质细胞,并进一步纯化小胶质细胞和星形胶质细胞,经纯度鉴定后,用感染复数为2的流感病毒H1N1和H5N1进行体外感染,8小时后用免疫荧光检测流感病毒核蛋白(NP)的表达,以确认感染细胞比例。在感染早期(6小时)和感染中期(24小时)分别提取细胞RNA,检测趋化因子转录水平的变化。结果:分离得到小鼠的小胶质细胞和星形胶质细胞,病毒感染后超过95%的细胞可以被感染,感染后的小胶质细胞与星形胶质细胞的CCL-3、CCL-5、CXCL-2、CXCL-9和CXCL-10的转录水平发生不同程度的上调,其中CXCL-10的上调幅度最为明显,禽流感病毒H5N1感染能诱导更强烈的上调反应。结论:流感病毒H1N1和H5N1感染小鼠小胶质细胞与星形胶质细胞,可诱导趋化因子转录水平上调。; 王革非李卫中张衡曾俊张丹桂陈幼莹陈小璇李康生; 关键词：小胶质细胞星形胶质细胞趋化因子

人APOBEC-3F和-3G的克隆表达、亚细胞定位及其抑制HBV的研究被引量：2: 2009年; 载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic-polypeptide,APOBEC)家族成员,是近年来发现的具有抗病毒作用的天然免疫分子,对HIV和HBV等多种病毒具有抑制作用,为研究APOBEC的抗病毒作用,对APOBEC-3F和-3G进行克隆、表达及亚细胞定位分析.HBV主要的生物合成发生于细胞核中,利用核定位信号(NLS)及二联核定位信号(B-NLS)与APOBEC-3F和-3G融合表达,以进一步了解APOBEC-3F和-3G的亚细胞定位及功能.利用RT-PCR从植物凝集素(PHA)刺激的人外周血淋巴细胞RNA中,对APOBEC-3F和-3G进行克隆,利用HindⅢ和KpnⅠ双酶切插入到pcFlag载体中,脂质体转染MDCK细胞后利用免疫荧光检测APOBEC重组蛋白的亚细胞定位.电泳结果表明,RT-PCR扩增得到APOBEC-3F和-3G基因,双酶切鉴定结果表明,APOBEC真核表达载体构建成功,基因序列经DNA测序证实.免疫荧光结果表明,转染表达后的APOBEC-3F和-3G均定位于细胞胞浆中.APOBEC-3F和-3G可以在HepG2.2.15细胞中显著抑制HBV的复制.可以有效转运绿色荧光蛋白(GFP)入核的NLS及B-NLS,不能将APOBEC-3F和-3G有效地转运至核中.成功地对APOBEC家族中的两个重要成员APOBEC-3F和-3G进行了克隆、表达及亚细胞定位研究,为进一步利用APOBEC家族蛋白开发抗HIV及HBV药物提供基础.; 王革非彭程李卫中辛岗苏芸陈幼莹林桂梅李康生; 关键词：载脂蛋白B 亚细胞定位 HBV 核定位信号

不同亚型流感病毒NS1蛋白在酵母菌细胞中转录激活功能的差异: 2009年; 非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NS1)是甲型流感病毒一种重要的调控蛋白,与病毒的毒力密切相关.本文检测了不同亚型流感病毒NS1蛋白在酵母菌细胞中的基因转录激活能力.将携带NS1基因的诱饵载体与空的猎物载体共转化AH109和Y187酵母菌细胞,观察AH109在QDO培养基上的生长情况,以X-α-gal为底物检测其分泌α-半乳糖苷酶的能力;通过ONPG实验定量分析Y187酵母菌细胞β-半乳糖苷酶活性的强弱.结果发现转化H1N1,H5N1和H9N2亚型流感病毒NS1基因的AH109酵母菌细胞能够在QDO培养基上生长,并分泌高水平的α-半乳糖苷酶.同时这些基因转化的Y187酵母菌细胞具有很强的β-半乳糖苷酶活性.与此相反,H3N2亚型流感病毒NS1基因转化AH109和Y187后,上述实验结果均为阴性.这说明H1N1,H5N1和H9N2亚型的NS1蛋白具有刺激酵母菌细胞基因转录的功能,而H3N2亚型的NS1蛋白缺乏这种能力,表明NS1蛋白型别的不同可造成其生物学活性的差异.; 李卫中王革非曾俊张丹桂张衡陈小璇陈幼莹李康生; 关键词：流感病毒 NS1蛋白酵母双杂交转录激活

A型流感病毒NS1蛋白羧基端PL结构域影响NS1在细胞核内的定位被引量：3: 2010年; A型流感病毒NS1蛋白羧基端4个氨基酸可以与PDZ结构域(the domain of PSD95,Dig and ZO-1)相结合,称为PL结构域(PDZ ligand domain).对不同亚型或毒株的流感病毒而言,其NS1蛋白PL结构域的组成存在比较大的差异.有研究发现这种差异能够影响NS1与宿主细胞蛋白的相互作用进而影响病毒的致病力.为进一步探讨PL结构域对NS1蛋白生物学特性的影响,首先构建出4种不同亚型流感病毒(H1N1、H3N2、H5N1、H9N2)来源的NS1绿色荧光蛋白表达质粒.在此基础上,对野生型H3N2病毒NS1表达质粒进行人工改造,将其PL结构域缺失或者替换为其他亚型流感病毒的PL结构域,制备出4种重组NS1蛋白表达质粒.通过比较上述不同NS1蛋白在HeLa细胞中的定位情况发现,只有野生型H3N2病毒的NS1蛋白可以定位于核仁当中,而野生型H1N1、H5N1、H9N2病毒的NS1蛋白以及PL结构域缺失或替代的H3N2病毒NS1蛋白都不能定位于核仁.而通过比较上述NS1蛋白在流感病毒易感的MDCK细胞中的定位,进一步发现所有这些蛋白均不定位于核仁.上述结果表明:PL结构域的不同可以明显影响NS1蛋白在HeLa细胞核内的定位和分布,这有可能造成其生物学功能的差异.同时,NS1蛋白在细胞核内的定位还与宿主细胞的来源有着密切关系.; 张丹桂李卫中王革非张衡曾俊陈幼莹张驰曾祥兴李康生; 关键词：A型流感病毒 NS1蛋白核仁

组蛋白乙酰转移酶PCAF在原核细胞的表达及其生物学活性检测: 2009年; p300/CBP相关因子(p300/CBP-associated factor,PCAF)是真核细胞内一种重要的组蛋白乙酰转移酶,它主要通过催化核心组蛋白的乙酰化,促进特定基因的转录,参与细胞内多种生物学过程。国内目前尚没有制备出具有生物学活性的组蛋白乙酰转移酶PCAF的报道。为此,PCAF全长cDNA被克隆入原核表达载体pGEX-5X-1,通过对诱导条件进行优化,实现了PCAF在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中的高效可溶性表达并进行了亲和纯化。利用体外乙酰转移酶活性分析实验,检测到所表达的GST-PCAF融合蛋白能够使组蛋白H3发生乙酰化。这种具有生物学活性的PCAF蛋白的成功制备为进一步研究PCAF的转录调控功能以及它与其它蛋白间的相互作用奠定了基础。; 李卫中张丹桂曾俊王革非陈小璇陈幼莹李康生; 关键词：原核表达

油甘清除活性氧作用研究Ⅱ.有效成分的初步评价被引量：7: 1994年; 本文对油甘果的成分和果汁清除活性氧作用的有效成分进行了初步分析与评价.结果发现,油甘果清除活性氧的成分除SOD外,尚有有机酸、单宁及维生素C.维生素C含量达每百克果肉508mg以上,是油甘果清除O_2^(-)的重要成分.实验证明,油甘果汁中,SOD-L活性(类SOD活性)和维生素C量均随贮存时间的延长而下降,其线性回归极显著,但对热比较稳定.; 俞丽君张尔贤肖湘陈幼莹黄卫群; 关键词：油甘馀甘活性氧超氧阴离子维生素C

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陈幼莹

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