陆施娟
- 作品数：20 被引量：8H指数：2
- 供职机构：南通大学医学院更多>>
- 发文基金：南通市应用研究计划项目江苏省高等学校大学生实践创新训练计划项目江苏省普通高校研究生科研创新计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶/半胱氨酸蛋白酶抑制剂复合基因真核重组质粒的构建与表达被引量：2
- 2011年
- 目的 构建周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氰酶/半胱氨酸蛋白酶抑制剂（GAPDH/CPI）复合基因真核重组表达质粒,为研制复合多价疫苗奠定基础.方法 依据GenBank中BmGAPDH及BmCPI基因序列设计引物,以周期型马来丝虫总RNA为模板,RT-PCR扩增目的 编码基因.PCR产物经TA克降后,克隆至载体pGEM-T Easy中.取阳性重组质粒pGEM-T/BmGAPDH和pGEM-T/BmCPI以及真核重组表达载体分别双酶切,将酶切后的载体和目的 片段进行连接,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1（＋）/BmGAPDH/BmCPI.将复合基因重组质粒瞬时转染人HeLa细胞后,进行RT-PCR验证,将表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析和鉴定.结果 分别克隆了pGEM-T/BmGAPDH和pGEM-T/BmCPI重组质粒,经酶切鉴定分别得到877、621 bp特异性片段,与预期值吻合.成功构建了复合基因重组真核表达载体pcDNA3.1（＋）/BmGAPDH/BmCPI,酶切鉴定所产生的片段大小与预期吻合.复合基因真核重组表达质粒转染HeLa细胞后得到高水平表达,SDS-PAGE分析显示重组蛋白相对分子质量（Mr）约为54×103.结论 成功构建了周期型马来丝虫GAPDH/CPI复合基因重组表达质粒,并在哺乳动物细胞内得到正确表达.
- 刘晓骏郭晓峰张赛楠陆施娟方浩徐邦生方政
- 关键词：半胱氨酸蛋白酶抑制剂HELA细胞
- 周期型马来丝虫CPI基因真核表达载体的构建及DNA免疫研究
- 目的：构建周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(BmCPI)基因真核表达载体poDNA3．1-BmCPI，并观察其在小鼠体内的细胞免疫应答效应。方法：以周期型马来丝虫总RNA为模板，RT-PCR方法扩增出目的基因片段。与p...
- 方政张赛楠陆施娟童海燕方浩徐邦生
- 关键词：周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂真核表达载体细胞免疫应答
- 周期型马来丝虫复合表位基因的构建及在真核细胞中的表达
- 2022年
- 目的构建周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂/3-磷酸甘油醛脱氢酶复合表位基因(CPI502/GAPDH720)真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720,并观察其在人宫颈癌细胞(Hela细胞)中的蛋白表达。方法根据T细胞表位预测的基因序列设计引物,以质粒pGEM-T-CPI621为模版,利用反转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因片段,将该片段克隆至原核表达质粒pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET28a(+)-BmCPI502。根据软件设计合适引物,RT-PCR分别扩增BmCPI502基因和BmGAPDH720基因,pcDNA3.1(+)、BmCPI502、BmGAPDH720分别进行双酶切后进行连接,构建复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720。将复合表位基因重组质粒转染至Hela细胞后,进行RT-PCR验证,获得与预期相符目的条带;将表达产物利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测。结果获得了原核表达重组质粒pET28a(+)-BmCPI502,经酶切鉴定得到502 bp特异性片段,与预期值符合;成功构建了复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720,酶切鉴定所产生的片段大小与预期符合;复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720转染Hela细胞后得到稳定表达,SDS-PAGE鉴定分析显示重组蛋白相对分子质量(Mr×10^(3))约为50。结论成功构建了周期型马来丝虫复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720,并在真核细胞中获得相应的重组蛋白,为进一步研究重组蛋白纯化和测定其生物学活性奠定了基础。
- 陆施娟蒋晗夏瑜椰方政
- 关键词：周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂3-磷酸甘油醛脱氢酶
- 周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的制备方法
- 本发明公开了一种周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的制备方法，以我国流行的周期型马来丝虫为研究对象，扩增马来丝虫myosin基因片段，构建了周期型马来丝虫myosin真核表达重组质粒。根据测序结果分析，推测其氨基酸序...
- 方政吴佳倩徐倩方浩张波陆施娟陶然刘芹谢东方
- 文献传递
- 易操作周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的制备方法
- 本发明公开了一种易操作周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的制备方法，以我国流行的周期型马来丝虫为研究对象，扩增马来丝虫myosin基因片段，构建了周期型马来丝虫myosin真核表达重组质粒。根据测序结果分析，推测其氨...
- 方政吴佳倩徐倩方浩张波陆施娟陶然刘芹谢东方
- 易操作周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的制备方法
- 本发明公开了一种易操作周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的制备方法，以我国流行的周期型马来丝虫为研究对象，扩增马来丝虫myosin基因片段，构建了周期型马来丝虫myosin真核表达重组质粒。根据测序结果分析，推测其氨...
- 方政吴佳倩徐倩方浩张波陆施娟陶然刘芹谢东方
- 文献传递
- 周期型马来丝虫CPI基因真核表达载体的构建和免疫学研究被引量：2
- 2011年
- 目的构建周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(BmCPI)基因真核表达载体pcDNA3.1-BmCPI,并观察其在小鼠体内的免疫应答反应。方法以周期型马来丝虫总RNA为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因片段。与pGEM-T Easy克隆载体连接,筛选出阳性克隆,经PCR和双酶切鉴定后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1,构建pcDNA3.1-BmCPI表达载体。将48只小鼠随机分为4组,每组12只,分别为健康对照组、空质粒组、pcDNA3.1-BmCPI组和pcDNA3.1-BmCPI/CpG组,分别注射PBS 100μl、空质粒pcDNA3.1 100μg、重组质粒pcDNA3.1-BmCPI100μg和重组质粒pcDNA3.1-BmCPI 100μg+佐剂CpG 30μg,采用左后腿胫前肌注射免疫。每2周1次,共3次,于末次免疫后第4周,用RT-PCR方法检测小鼠注射部位肌肉组织内目的基因转录情况。于末次免疫后第4和第6周,用噻唑蓝(MTT)法检测小鼠T淋巴细胞刺激增殖水平。于末次免疫后第2、4和6周,用ELISA法检测小鼠血清γ干扰素(IFN-γ)和白介素-4(IL-4)水平。结果成功构建了pcDNA3.1-BmCPI真核表达载体,基因片段大小为621 bp。该真核表达载体免疫小鼠后,从小鼠肌肉组织扩增出目的基因。末次免疫后第4和第6周,2个免疫组小鼠淋巴细胞刺激增殖指数均显著高于健康对照组和空质粒组(53.789±1.937、59.735±4.139和61.975±1.029)(均P<0.05),2个免疫组间差异无统计学意义(P>0.05)。于末次免疫后第2、4和6周,pcDNA3.1-BmCPI组和pcDNA3.1-BmCPI/CpG组小鼠血清IFN-γ水平随时间延长逐渐升高,分别为69.544±3.145和106.069±7.518、120.019±5.968和136.229±7.198、149.109±2.700和178.429±1.126,均显著高于健康对照组和空质粒组(28.264±1.129、35.179±1.029和40.110±1.176)(均P<0.05),其中末次免疫后第2和第6周,pcDNA3.1-BmCPI/CpG组IFN-γ水平显著高于pcDNA3.1-BmCPI组(均P<0.05)。于末次免疫后第4和第6周,2个免疫组的IL-4水平均显著高于健康对照组和空质粒组(均P<0.05),2个免疫组间差异均无统
- 张赛楠方政陆施娟王慧徐邦生
- 关键词：马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂真核表达载体免疫
- 周期型马来丝虫复合多价蛋白疫苗的制备方法
- 本发明公开了一种周期型马来丝虫复合多价蛋白疫苗的制备方法，包括周期型马来丝虫pcDNA3.1（+）-BmCPI/BmGAPDH重组质粒的抽提、基因转染、阳性克隆的筛选、阳性克隆的提取和扩大培养、阳性克隆的冻存、检测阳性克...
- 方政王慧方浩陆施娟徐倩胡迎青童海燕徐邦生
- 文献传递
- 周期型马来丝虫复合基因重组质粒和相应表达蛋白的免疫学研究被引量：2
- 2014年
- 目的构建周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂／3-磷酸甘油醛脱氢酶（BmcPI／，BmGAPDH）复合基因重组质粒，并转染人宫颈癌细胞（Hela）进行重组蛋白表达。将重组质粒和相应表达蛋白进行免疫学研究比较。为研制新型的抗丝虫基因工程疫苗提供理论及实验依据。方法扩增周期型马来丝虫目的编码基因。将目的基因片段和载体分别双酶切后进行连接，构建复合基因重组质粒pcDNA3．1（＋）-BmCPI/BmGAPDH，鉴定后转染Hela细胞，以G418筛选转染细胞，进而通过RT-PCR和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）鉴定G418筛选后的单克隆抗性细胞株。亲和层析纯化所表达的重组蛋白并通过免疫蛋白印迹法（Westernblot）对纯化的重组蛋白进行生物学鉴定。60只BALB／c小鼠分5组，每组12只，第2、4、6周分别免疫1次。磷酸盐缓冲液（PBS）对照组为注射PBS100μl；空质粒／CpG对照组为注射pcDNA3．1100μg和CpG30μg；复合重组质粒／CpG组为注射pcDNA3．1-BmCPI／BmGAPDH100μg和CpG30μ；复合重组蛋白／CpG组为注射pcDNA3．1-BmCPI／BmGAPDH复合重组蛋白50P-g和CpG30μg；复合重组质粒／复合重组蛋白／CpG组前2次注射pcDNA3．1-BmCPI／BmGAPDH100μg和CpG30μg；后1次注射pcDNA3．1-BmCPI／BmGAPDH复合重组蛋白50μ和CpG30μg。用RT—PCR方法检测肌肉组织内目的基因；用酶联免疫吸附试验（ELISA）、特异性增殖试验（MTT法）分别检测免疫小鼠血清抗体效价、T淋巴细胞刺激增殖指数和血清中细胞因子干扰素（INF）-γ、白细胞介素（IL）-4水平。结果复合重组质粒pcDNA3．1（＋）-BmCPI／BmGAPDH免疫小鼠后，从小鼠肌肉组织扩增出目的基因。复合重组质粒／复合重组蛋白／CpG组小鼠免疫4、6周后血清抗体效价（1695．12±1．43、3199．63±1．34）均高于复合重组质粒／CpG组（712．69±1．08、1510．08±1．43，P均〈0．05
- 王慧方政徐倩陆施娟钱一言徐怿琳方浩徐邦生
- 关键词：马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂3-磷酸甘油醛脱氢酶复合基因表达蛋白
- 周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的用途
- 本发明公开了一种周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的用途，以我国流行的周期型马来丝虫为研究对象，扩增马来丝虫myosin基因片段，构建了周期型马来丝虫myosin真核表达重组质粒。根据测序结果分析，推测其氨基酸序列，...
- 方政吴佳倩徐倩方浩张波陆施娟陶然刘芹谢东方
- 文献传递
