江南大学药学院制药工程研究室
- 作品数：8 被引量：23H指数：2
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- 相关领域：轻工技术与工程化学工程生物学更多>>
- 重组瑞替普酶在毕赤酵母中的表达
- 2017年
- 【目的】瑞替普酶(重组组织纤溶酶原激活物,rt PA)被认为是第三代安全有效的溶栓剂,以p PIC9K为载体,以3种不同表型的毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主,探索适合rt PA分泌型表达的最佳体系。【方法】以质粒p ET28a-rt PA为模板,设计特异性引物,PCR扩增目的基因rt PA,插入分泌型表达载体p PIC9K中,获得重组表达质粒p PIC9K-rt PA。重组质粒经限制性内切酶Sal I线性化后,电击转化至3种不同表型的P.pastoris(GS115、SMD1168、KM71)中进行组成型表达;重组表达体系进行甲醇诱导表达,对产物进行Western blot鉴定,并采用纤维蛋白平板溶圈法测定其活性。【结果】重组蛋白分子量约为43 k D;rt PA-GS115和rt PA-KM71均在39 k D处有特异性条带,且前者在32 k D处有轻微降解条带,而后者并无此现象;rt PA-SMD1168无降解现象,且rt PA-SMD1168比活性较rt PA-GS115高27%;rt PA-KM71表达量和活性均为最低。【结论】从重组蛋白生物活性出发,P.pastoris SD1168可作为rt PA的最佳表达体系,在控制宿主蛋白酶活性、减少产物降解的前提下,P.pastoris GS115也是rt PA表达的优选体系。
- 张旦旦窦文芳赵军史劲松许正宏
- 关键词：瑞替普酶组织纤溶酶原激活物毕赤酵母纤溶活性
- 融合蛋白GGHN端延长类似物的克隆表达、纯化及活性研究被引量：1
- 2013年
- GGH是人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白(GLP-1A2G)2-HSA的简称,为研究N端添加丙氨酸的修饰对其活性的影响,通过基因工程方法成功构建表达该类似物的工程菌,并纯化得到终产物,完成了初步体外活性检测。首先运用PCR技术扩增出融合蛋白GGH类似物的基因片段,以pPIC9K为表达质粒构建了重组表达质粒,将双酶切和测序验证正确的重组质粒电转至分泌型菌株毕赤酵母GS115,然后经过MD平板筛选获得转化子,利用甲醇诱导表达72 h,SDS-PAGE检测上清产物与未修饰的GGH对比,得到阳性转化子。融合蛋白经过发酵液8 000 r/min离心10 min,0.45μm的微孔滤膜微滤,采用截留分子量为10 kD的超滤膜超滤20倍,再依次经过Blue Sepharose 6 Fast Flow、Phenyl Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow、Sephadex G-25层析柱。在RINm5f细胞上测cAMP的生成,通过与阳性对照的标准曲线对比发现,A-GGH活性比GGH提高10倍,表现出较好的体外活性。
- 冯均尚窦文芳张晓梅许泓瑜史劲松许正宏
- 关键词：类似物毕赤酵母纯化活性
- 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶介导的草酰乙酸回补途径对谷氨酸棒杆菌V1氨基酸代谢的影响被引量：2
- 2017年
- 【目的】谷氨酸棒杆菌是工业生产氨基酸的主要菌株,以缬氨酸高产菌株谷氨酸棒杆菌V1为研究对象,探讨磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)介导的草酰乙酸回补途径对菌株生理特性以及主要氨基酸代谢流量的影响。【方法】通过基因工程手段,在谷氨酸棒杆菌V1中过表达pepc(编码PEPC)和pck(编码PCK),比较重组菌与出发菌关键酶活性、发酵特性以及主要氨基酸积累量变化。【结果】构建两株重组菌V1-pepc(强化草酰乙酸回补途径)和V1-pck(弱化草酰乙酸回补途径),重组菌生长均较出发菌延缓,总生物量、葡萄糖和硫酸铵消耗基本不变;过表达pck,PCK活性提高22.8%,丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸、精氨酸积累量分别提高了11.8%、17.2%、27.8%和19.5%;过表达pepc,PEPC活性提高27.5%,同时PC活性降低12.9%,天冬氨酸族和谷氨酸族氨基酸的整体流量变化不大,丙氨酸族氨基酸的整体流量降低了14.7%。【结论】丙氨酸族氨基酸受此回补途径影响较大,天冬氨酸族氨基酸受此影响较小。
- 张旦旦仇爱梅鲍勇窦文芳许正宏
- 关键词：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶
- 固态发酵食醋有机酸组成分析中样品预处理方法的研究被引量：13
- 2013年
- 比较了4种大分子杂质沉淀方法和4种小分子杂质去除方法对食醋有机酸HPLC分析结果的影响。结果表明,亚铁氰化钾-硫酸锌法可有效地沉淀食醋样品中的生物大分子物质,Sep-PakC18固相萃取小柱可有效的去除样品中色素等小分子杂质。该方法简单、操作方便,成功地排除了食醋中蛋白、色素等复杂成分对有机酸HPLC分析的干扰。
- 余永建邓晓阳陆震鸣史劲松许正宏
- 关键词：食醋HPLC有机酸预处理
- 加强表达3-磷酸甘油醛脱氢酶对谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的影响被引量：2
- 2016年
- 在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中,由3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)催化的反应是糖酵解途径的限速步骤,该反应还直接影响了L-丝氨酸的前体3-磷酸甘油酸的合成。研究首先比较了产L-丝氨酸的野生型菌株C.glutamicum SYPS-062与模式菌株C.glutamicum ATCC14067的GAPDH酶活力,发现SYPS-062的GAPDH酶活力比ATCC14067高了55.8%。进一步采用在C.glutamicum33a△SS基因组上增加gap A拷贝数的方法加强表达GAPDH,构建了重组菌C.glutamicum33a△SS-2gap A。重组菌GAPDH转录水平和酶活力分别提高119%和53%,最大比生长速率提高10.6%,总糖耗速率提高4.4%,L-丝氨酸产量提高17.4%,糖酸转化率提高12.2%,生产强度提高17.4%。结果表明,加强表达GAPDH能够提高重组菌的生长和糖耗速率,并能够提高L-丝氨酸的产量、糖酸转化率和生产强度。
- 郭雯赖联贺张晓梅史劲松许正宏
- 关键词：3-磷酸甘油醛脱氢酶谷氨酸棒杆菌L-丝氨酸
- 前体物质和碳源补加策略对缺陷短波单胞菌发酵生产L-脯氨酸的影响
- 2012年
- 对缺陷短波单胞菌(Brevndimonas diminut)JNPP-NSS产L-脯氨酸的补料分批发酵条件进行了研究。结果表明,发酵初始添加50 g/L前体物质谷氨酸,以最适初始葡萄糖浓度100 g/L,于35 h以3.0 g/(L.h)的流速补加葡萄糖,使总糖浓度达120 g/L的补碳方式,L-脯氨酸的合成浓度有所提高。发酵结束,L-脯氨酸的终浓度提高到54.40 g/L,底物葡萄糖对L-脯氨酸的转化率达到0.45 g/g。
- 李会赵世杰窦文芳史劲松许正宏
- 关键词：L-脯氨酸前体物质碳源补料分批发酵
- 外源调控叶酸代谢对谷氨酸棒杆菌SYPS-062积累L-丝氨酸的影响被引量：1
- 2014年
- 通过外源添加叶酸合成前体对氨基苯甲酸、叶酸途径抑制剂氨甲喋呤扰动叶酸代谢,考察了叶酸对谷氨酸棒杆菌SYPS-062合成L-丝氨酸的影响。实验结果表明,添加对氨基苯甲酸（0-0.4μg/mL）能够促进菌体的生长（最大值为7.8±0.24 g/L）,但可显著降低其产酸能力;而添加氨甲喋呤（0-100μg/mL）抑制了谷氨酸棒杆菌SYPS-062的生长,但可提高其单位菌体产酸的能力;代谢通量分析表明,作为调控点的叶酸代谢在SYPS-062生长及积累L-丝氨酸中占主导地位。
- 徐国强袁圣男任建洪张晓梅许正宏
- 关键词：谷氨酸棒杆菌叶酸代谢L-丝氨酸
- 钝齿棒杆菌的代谢改造:L-鸟氨酸与L-瓜氨酸合成菌株的构建被引量：4
- 2014年
- 【目的】对一株产L-精氨酸的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5进行代谢工程改造,构建L-鸟氨酸和L-瓜氨酸合成菌株,并考察其发酵生产相应氨基酸的性能。【方法】分别敲除菌株SYPA5-5鸟氨酸氨甲酰转移酶(Ornithine carbamoyltransferase,OTC)的编码基因argF和精胺琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthase,ASS)的编码基因argG,构建能够合成L-鸟氨酸及L-瓜氨酸的重组菌株SYPA5-5△argF和SYPA5-5△argG;考察不同营养条件对上述重组菌株生长和相应氨基酸积累的影响。【结果】添加0.3 g/L L-精氨酸可满足SYPA5-5△argF的生长及L-鸟氨酸积累所需,L-鸟氨酸产量可达21.5 g/L;添加L-精氨酸有利于SYPA5-5△argG的生长,但不利于L-瓜氨酸的积累;不添加L-精氨酸时,L-瓜氨酸产量可达15.2 g/L,同时积累6.8 g/L的L-谷氨酸。【结论】分别敲除L-精氨酸生产菌株SYPA5-5的argF及argG基因,可实现L-精氨酸合成途径的中间代谢物L-瓜氨酸和L-鸟氨酸的积累,拓展了该菌株的工业应用范围。
- 赵芹芹罗玉常窦文芳张晓梅耿燕许正宏
- 关键词：L-鸟氨酸钝齿棒杆菌ARGG
