温州医学院生命科学学院浙江省医学遗传学重点实验室
- 作品数：12 被引量：39H指数：4
- 相关作者：阮冬芬陈忠义凌雪梅王欣珍邵薇薇更多>>
- 发文基金：浙江省自然科学基金温州市科技计划项目浙江省重大科技专项基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学环境科学与工程更多>>
- CEQ^(TM)8800型遗传分析系统检测DNA序列的影响因素研究被引量：1
- 2006年
- 目的:研究DNA循环测序过程中一些影响因素及其序列图谱。方法:对测序中模板、引物、测序反应条件和体系及其产物的纯化等因素进行比较研究。结果:模板因素是测序成败的主要原因,模板的质量直接影响着测序图谱;引物失效,与模板匹配不完全,Tm值过低等因素也能引起测序失败;利用乙醇沉淀纯化测序反应产物、效果好且简单、经济。结论:模板的纯度和浓度对测序成功与否起决定作用。最佳反应条件可降低成本,提高测序成功率。仪器操作熟练、正确与否也会影响测序结果。
- 季敬璋张洁吕建新
- 关键词：DNA测序影响因素
- 线粒体DNA序列分析封闭群小鼠遗传稳定性被引量：3
- 2009年
- 目的分析ICR小鼠线粒体ATPase6和D—Loop基因多态性及封闭群ICR小鼠遗传稳定性。方法在一个亲本雌鼠100只繁殖产生的共1000只后代群体中随机取12周龄雄鼠20只，提取小鼠睾丸生殖细胞DNA，PCR扩增小鼠线粒体ATPase6和D-Loop基因，产物纯化后测序，测序结果与小鼠线粒体标准序列比对，比较20只小鼠的序列差异。结果检测的20只小鼠ATPase6和D—Loop基因序列完全一致，且与小鼠线粒体标准序列完全一致。结论ICR小鼠群体内未检测到ATPase6和D—Loop基因的多态性变异，该群体具有较好的线粒体遗传稳定性。
- 管敏强曹琼洁陈忠义阮冬芬楼哲丰金龙金
- 关键词：线粒体D-LOOP
- PCR-RFLP和PCR-SSCP方法对弱精子症精子mtATPase6基因突变的检测被引量：7
- 2007年
- 为了检测弱精子症精子mtATPase6基因突变,采用PCR方法扩增了17例弱精子症mtDNA8602～9416区域815bp目的片段,用MspI和HaeⅢ限制性内切酶酶切,分别用琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和单链构像多态性(SSCP)筛查突变。筛选出3例突变标本,经测序确认突变位点和突变性质。结果显示17例标本全部扩增出mtDNA8602～9416的815bp目的片段,PCR产物经MspI限制性内切酶酶切后电泳结果与剑桥序列预期酶切图谱相一致。PCR产物经HaeⅢ酶切,聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上出现泳动带的异常,在17例弱精子症中共筛选出2例酶切片段异常标本。PCR-HaeⅢ酶切产物的SSCP电泳图谱分析结果显示,在PCR-RFLP(HaeⅢ)电泳图谱正常的15例弱精子症标本中筛选出1例异常。两种方法在弱精子症精子标本中筛选出mtATPase6基因突变3例(3/17,17.7%)。3例测序结果发现A8701G、C8943T、C8964T、T8966C、G9053A、C9060A、C9075T、A9120G、C9296T共9个点突变,其中A8701G、T8966C、G9053A三个突变为错义突变,其余均为同义突变。上述结果提示,弱精子症精子mtATPase6基因存在较高突变率;PCR-RFLP和PCR-SSCP能简单、快速、灵敏地筛选mtATPase6基因突变。
- 金龙金张春玲楼哲丰张李雅陈林丽李玮吕建新
- 关键词：弱精子症点突变PCR-RFLPPCR-SSCP
- mtND4基因突变与弱精子症精子的相关分析被引量：4
- 2011年
- 目的分析弱精子症精子mtND4基因突变与弱精于症的相关性，探索弱精子症的分子病因。方法按WHO标准收集56例弱精子症精液标本和44例精子活力正常精液标本，用3对引物PCR扩增mtND4基因，纯化测序，分析mtND4基因突变，比较2组标本mtND4基因突变及多重单核苷酸多态性（SNP）的差异。结果发现31个同义突变位点和12个错义突变位点，其中6个核苷酸变异位点未报道过，分别为A11026G、C11215T、A11488G、C11713T、C12908T、T10908C。对照组mtND4基因T10873C和T11944C变异率分别为61．4％（27／44）和11．4％（5／44），显著高于弱精子症组的39．3％（22／56）和0％（P〈0．05）；除T10873C和TI1944C变异外，错义突变分析发现，对照组10例中与T10873C或T11944C组成多重SNP8例，而弱精子症组10例标本中仅2例，2组间比较差异有统计学意义（P〈0．05）；上述20例错义突变标本分成多重SNP组（与T10873C或T11944C）和非多重SNP组，多重SNP组a级精子百分率和a＋b级精子百分率均显著高于非多重SNP组（P〈0．05）。结论mtND4基因错义突变可能影响精于活动力，T10873C和T11944C多态性变异对精子活动力可能是一个有益因子，两者同时存在组成多重SNP时，两者的作用可能具有相互抵消的效应。
- 李传连郑九嘉杨宗黄学锋方可欣楼哲丰吴永根金龙金
- 关键词：弱精子症基因突变多态性单核苷酸
- 含anti-erbB2的重组表达载体的构建及其在T细胞株中的表达
- 2010年
- 目的:构建含融合基因anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)的T细胞株,为erbB2过度表达肿瘤的靶向基因治疗奠定实验基础。方法:利用SWISS MODEL和PHYRE预测该融合蛋白的三级结构。利用PCR分别从重组质粒pPIC9k、pBullet和pLNCX上扩增出3段基因片段,即片段anti-erbB2 scFv、片段Fc-CD28-CD3(ζ)和信号肽序列signal。利用SOE-PCR将3段序列连接形成融合基因片段signal-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)。经TA克隆扩增及鉴定后,将融合基因片段与逆转录病毒表达载体pLNCX相连构建重组真核表达载体,脂质体方法转染人T淋巴细胞株Jurkat,G418筛选后用流式细胞术检测融合蛋白稳定表达情况。结果:经预测该融合蛋白在三级结构上可形成功能构象。经PCR、酶切及测序鉴定均证实成功构建重组真核表达载体pLNCX/signal-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)。经流式细胞术检测,在Jurkat细胞中表达量达23.68%。结论:应用分子克隆的方法成功地构建了重组真核表达载体pLNCX/anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ),融合基因能够在T淋巴细胞株中表达,为制备含该融合基因的原代T淋巴细胞,进行erbB2过度表达肿瘤的靶向基因治疗研究奠定了基础。
- 苏世振隋文君李红智布立敬胡望雄
- 关键词：ERBB2基因融合T淋巴细胞
- mt ND2基因多态性及mRNA表达与弱精子症的相关性分析
- 为了探讨线粒体ND2(mt ND2)基因多态性及其mRNA的表达与弱精子症的相关性,按WHO标准收集了147例弱精子症和124例精子活力正常的精液标本,PCR测序、双向等位基因PCR(Bi-PASA)技术或反转录-聚合酶...
- 郑九嘉黄学锋杨宗杨旭张李雅吕建新金龙金
- 关键词：弱精子症点突变基因变异
- 弱精子症精子线粒体DNA A3 243G,G3 316A和T3 394C突变的检测
- 2009年
- 目的:检测弱精子症精子线粒体tRNAleu 3 243位点、线粒体ND1 3 316位点和3 394位点碱基突变频率,分析三个位点突变与弱精子症的相关性。方法:按WHO标准随机收集了69例弱精子症患者精子标本和60例正常人正常活动力精子标本,以聚合酶链反应、ApaⅠ和HaeⅢ限制性内切酶长度多态性分析和测序检测mtDNA A3 243G、G3 316A和T3 394C三个位点的突变,比较两组突变频率的差异。分析G3 316A和T3 394C突变的氨基酸变异情况并结合生物信息学工具分析错义突变氨基酸进化保守性。结果:弱精子症精子mtDNA G3 316A突变率(4.35%)、T3 394C突变率(2.90%)和总突变率(7.25%)与正常对照组(分别为5.00%、1.67%和6.67%)比较,差异无显著性。氨基酸变异分析发现,G3 316A(Ala->Thr)、T3 394C(Tyr->His)均为错义突变,其中T3 394C突变位点所编码的氨基酸在人、牛、小鼠、爪蟾4种生物中进化具有高度保守性。结论:G3 316A和T3 394C突变可能不是影响人类精子活动力的主要因素。
- 凌雪梅方可欣楼哲丰张巍张李雅金龙金
- 关键词：弱精子症MTDNA突变
- 重组人IL-18-EGF的双顺反子表达及其对NK细胞和肝癌细胞的影响被引量：2
- 2012年
- 构建重组人IL-18-EGF肿瘤靶向分子双顺反子原核表达系统,研究重组人IL-18-EGF融合蛋白对人自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)和人肝癌细胞(SMMC-7721)的影响。构建重组人IL-18-EGF原核双顺反子表达系统pET28a(+)-proIL-18-EGF-Caspase-4/BL21,重组蛋白经纯化后,作用于NK细胞,应用CCK-8法和ELISA试剂盒分别检测NK细胞的增殖情况和IFN-γ的分泌量。Cy3荧光标记IL-18-EGF检测融合蛋白与肿瘤细胞表面EGFR的结合情况。IL-18-EGF与NK细胞共同孵育24 h后,取培养上清液作用于人肝癌细胞SMMC-7721,分别使用细胞划痕实验和Transwell小室实验检测IL-18-EGF对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。实验结果显示:重组人IL-18-EGF能加快NK细胞的增殖,促进NK细胞分泌IFN-γ;IL-18-EGF能与肿瘤细胞表面EGFR特异性结合;细胞划痕实验中,重组人IL-18-EGF组空白区域的抗填充能力高于对照组;Transwell小室实验中,12,24,48 h时IL-18-EGF组细胞穿膜数分别为94.6±2.9、101.8±4.0和116.2±4.5,均显著低于相应时间的对照组(分别为128.6±8.5、133.0±7.5和138.8±5.4)(P<0.05)。以上结果表明,IL-18-EGF对人肝癌细胞SMMC-7721的迁移和侵袭能力有明显的抑制作用,能提高机体的免疫能力,有可能作为辅助药物运用于肝癌的治疗。
- 钟连进叶巍文杰洪德芳艾冬冬吕建新
- 关键词：NK细胞
- 镉对小鼠精子和生精细胞超微结构及生精细胞bcl-2、bax基因表达的影响被引量：10
- 2006年
- 研究镉暴露对小鼠附睾精子和睾丸生精细胞超微结构的变化以及镉对生精细胞凋亡相关基因bcl-2、bax表达水平的影响。采用24只雄性ICR小鼠随机分为4组,每组6只,分别以0.183、0.915、1.83mg/kg氯化镉腹腔注射,每天1次,连续5次,设阴性对照生理盐水组。于第6天透射电镜观察附睾精子超微结构、睾丸生精细胞核和线粒体超微结构的变化,免疫组化方法检测生精细胞Bcl-2、Bax表达水平。透射电镜观察显示,0.183mg/kg组精子超微结构无显著性变化,0.915mg/kg组精子头部两侧膜与头部胞质间隙轻微扩大,线粒体嵴间腔扩大且轻度空泡化,但与对照组相比无统计学意义(P>0.05)。1.83mg/kg组头部两侧膜与胞质间隙扩大,与对照组相比有显著性差异(P<0.05),尾部线粒体嵴间腔扩大且轻度空泡化,与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。3种剂量处理组睾丸生精细胞核超微结构异常发生率显著高于对照组(P<0.05),且随着处理浓度的升高异常发生率升高;1.83mg/kg组线粒体肿胀空泡化发生率显著高于对照组(P<0.05)。3种剂量实验组生精细胞Bcl-2表达水平(吸光度)显著低于对照组(P<0.01),0.915mg/kg组Bax表达水平显著高于对照组和0.183、1.83mg/kg组(P<0.01)。3种剂量实验组Bcl-2/Bax吸光度比值显著低于对照组(P<0.01);0.915mg/kg组Bcl-2/Bax比值显著低于1.83mg/kg组(P<0.01)。上述结果提示:高浓度镉诱导附睾精子超微结构改变,高中低浓度镉致睾丸生精细胞超微结构的改变,生精细胞超微结构发生凋亡现象。镉对Bcl-2、Bax表达水平的改变可能是生精细胞凋亡的分子机制之一。
- 金龙金方周溪楼哲丰张婵陈锡文
- 关键词：镉生精细胞超微结构BCL-2BAX
- mt ND2基因多态性与弱精子症的相关性分析被引量：4
- 2010年
- 为了探讨线粒体ND2(mt ND2)基因多态性与弱精子症的相关性,按WHO标准收集了134例弱精子症和1 12例精子活力正常的精液标本,PCR测序或双向等位基因PCR(Bi-PASA)技术分析ND2基因多态性,统计ND2基因4个位点多态性在两组间的差异。应用变性高效液相色谱(DHPLC)分析m.5442T>C和m.5466A>G多态性变异的异质性。结果发现了34个变异位点,其中6个位点未曾报道;ND2基因m.5351A>G、m.5460G>A和m.5466A>G变异率弱精子症组显著高于对照组(P<0.05),m.5442T>C变异率对照组显著高于弱精子症组(P<0.05);进一步分析m.5460G>A和m.5466A>G突变阳性标本精子活力显著低于突变阴性标本(P<0.001),m.5442T>C突变阳性标本精子活力显著高于突变阴性标本(P<0.001)。提示:ND2基因一些核苷酸变异(m.5351A>G、m.5460G>A和m.5466A>G)可能与弱精子症有关,m.5460G>A和m.5466A>G错义突变可能是精子活力的有害因素,而m.5442T>C多态性可能对精子活力具有一定的帮助。
- 郑九嘉黄学锋杨宗杨旭张李雅吕建新金龙金
- 关键词：弱精子症点突变基因变异
