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以主要流行EV71 VP1基因高度保守区为靶点的TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立被引量：4: 2016年; 在我国,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)C4型是引起手足口病的主要流行基因型。为建立EV71C4型TaqMan荧光定量PCR检测方法,在C4型EV71VP1基因的高保守区,设计合成引物和TaqMan探针,将包含此目的区段的基因片段克隆到pcDNA3.1载体中,通过体外转录获得标准品,并以梯度稀释的标准品为模板建立工作曲线,进而在优化反应条件的基础上建立TaqMan荧光实时定量PCR检测方法。实验中,所设计引物、探针的高度保守性保证了C4型EV71的高效扩增。经反应条件优化,引物和探针的最佳工作浓度分别为300 nmol/L和200 nmol/L,在1×10~301×10~3拷贝数检测范围内具有良好的线性关系(R^2=1),灵敏度可达到10~2 copies/μL。通过对该方法进行检验发现,批间和组间重复实验的变异系数均小于0.5%,且该方法对柯萨奇A16(coxsackievirus A16,CA16)柯萨奇B1(coxsackievirus B1,CB1)人轮状病毒(human rotavirus,HRV)单纯疱疹病毒2型(herpes Simplex virus type 2,HSV-2)均无交叉反应,对6份EV71阳性样本检出率为100%。以上数据表明,文中建立的TaqMan荧光定量PCR方法可为我国主要流行C4型EV71感染的快速诊断及疾病监控提供有效途径。; 胡晓星彭杰冯悦刘丽张阿梅夏雪山; 关键词：肠道病毒71型 VP1基因 TAQMAN探针荧光定量PCR

树鼩原代肾细胞的分离优化培养及EV71感染: 目的分离优化培养树鼩原代肾细胞,并探索EV71对树鼩肾细胞的感染性。方法胰蛋白酶-EDTA消化法分离得到的树鼩原代肾细胞,分别用10％FBS DMEM、5ng/mL10％FBS DMEM、10％FBS RPMI164...; 胡晓星彭杰冯悦刘阳夏雪山; 关键词：EV71 实时定量PCR

树鼩原代小肠上皮细胞对人轮状病毒增殖特性的研究: 目的：初步确认了人轮状病毒对树鼩原代小肠上皮细胞的感染性,研究了轮状病毒在树鼩原代小肠上皮细胞上的增殖特性. 方法：采用胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法获取树鼩小肠上皮细胞,并采用消化排除法获取单一小肠上皮细胞...; 彭杰胡晓星冯悦刘阳甸子芩夏雪山; 关键词：人轮状病毒细胞增殖感染性; 文献传递

中国人群肥厚型心肌病MYH7基因突变的研究与展望被引量：6: 2016年; 肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）是一种以左心室或室间隔不对称性肥厚为基本特征的最常见遗传性心脏病，该病是青少年及年轻运动员猝死的最主要原因。先天基因缺陷是HCM主要的分子遗传学基础，其遗传方式遵循常染色体显性遗传模式。与HCM发病相关的基因较多，其中编码心脏β-肌球蛋白重链（cardiac beta-myosin heavy chain, MYH7）基因为HCM最主要的致病基因。通过查阅文献，检索到目前已报道的587例中国HCM患者被进行MYH7基因突变筛查，统计结果表明：共有150例中国HCM患者由MYH7基因外显子上的66个致病性突变所致。对已报道的中国HCM人群MYH7基因的突变特点进行总结和分析．这将为中国HCM人群的诊断、预防和治疗提供参考依据。; 曹红赵跃冯悦张宏夏雪山; 关键词：肥厚型心肌病基因突变

狂犬病毒L蛋白加帽酶功能域的表达、纯化及多克隆抗体的制备与鉴定: 2024年; 目的克隆狂犬病毒(RABV)L蛋白的加帽酶功能域基因,构建原核表达载体,制备了多克隆抗体,为病毒诊断和抗病毒药物研发提供了有效工具。方法利用基因工程技术,扩增L蛋白加帽酶功能域的基因序列,与双酶切的pET-32a载体连接,获得pET-32a-RABV-L重组表达质粒。经过测序确认无碱基突变,将含pET-32a-RABV-L重组表达质粒的菌液扩大培养后,IPTG诱导表达重组蛋白。通过Ni-NTA亲和层析填料进行纯化,改变不同咪唑洗脱浓度,摸索出适合的洗脱条件。将纯化的蛋白与弗氏佐剂混合免疫小鼠,获得的小鼠多克隆抗体进行间接ELISA检测、Western blot检测、IFA检测。结果成功构建pET-32a-RABV-L原核表达质粒。RABV-L重组蛋白在大肠埃希菌中成功表达,大小约40 ku,且与His-tag的单克隆抗体发生特异性反应。免疫小鼠64 d后,采取的小鼠血清制备多克隆抗体,其工作效价达到25600,在Western blot检测和IFA检测中显示能特异性识别天然病毒L蛋白。结论成功表达、纯化RABV-L蛋白加帽酶功能域的重组蛋白,并成功获得特异性识别天然表位的多克隆抗体。; 张桃苹陈露徐瑞贤贾亭石文刚何淑桢胡腾王永博宋玉竹韩芹芹夏雪山张金阳; 关键词：L蛋白多克隆抗体

人G1型轮状病毒Taqman荧光定量检测方法的建立与应用: 目的本研究旨在建立一种快速准确定量检测人G1型轮状病毒的TaqMan探针荧光实时PCR检测方法.方法以轮状病毒VP6基因为靶基因,分别设计两对引物及其相应的Taqman探针,扩增目的片段,将目的片段克隆于PCDNA3...; 彭杰胡晓星冯悦甸子芩孙鷖牛华夏雪山; 关键词：人轮状病毒 VP6基因

人G1型轮状病毒TaqMan荧光定量检测方法的建立与应用被引量：1: 2016年; 目的本研究旨在建立一种快速准确定量检测人G1型轮状病毒的TaqMan探针荧光实时PCR检测方法。方法以轮状病毒VP6基因为靶基因,分别设计2对引物及其相应的TaqMan探针,扩增目的片段,将目的片段克隆于PCDNA3.1+载体上,体外转录获得RNA,系列稀释后为标准品,建立TaqMan探针荧光定量实时PCR检测方法并对该方法进行验证。结果设计实验找到最优条件下的引物浓度(250nmol/L)、探针浓度(300nmol/L);通过对引起腹泻的人柯萨奇病毒、呼肠孤病毒等进行检测,结果均为阴性,表明该方法具有很好的特异性。该方法的最低检测量为5copies/μL。对该方法进行重复性实验,发现变异率均小于1%,重复性好。用已建立的方法对4份粪便临床样品进行3次重复试验,病毒RNA的检出率为100%。结论本实验初步建立了人G1型轮状病毒TaqMan探针荧光实时PCR检测方法,为G1型轮状病毒的诊断、检测和分子流行病学研究提供了一种新的方法。; 彭杰胡晓星冯悦甸子芩孙鷖牛华夏雪山; 关键词：人轮状病毒 VP6基因

乙肝病毒DNA疫苗pHL-sec-LHBs的构建及小鼠免疫效果检测被引量：1: 2023年; 目的构建针对乙肝病毒的DNA疫苗,并检测该DNA疫苗免疫BALB/c小鼠的效果。方法选择乙肝病毒表面蛋白中的LHBs蛋白基因作为抗原基因,以pHL-sec真核外泌型质粒为载体构建pHL-sec-LHBs质粒。使用pHL-sec-LHBs质粒、pHL-sec-LHBs质粒瞬时转染细胞上清和pHL-sec空载质粒在无佐剂或有佐剂条件下分别对BALB/c小鼠进行免疫,共计免疫5次,每次间隔14 d。第5次免疫7 d后对小鼠进行LHBs蛋白特异性抗体检测。结果成功构建pHL-sec-LHBs重组质粒。使用该质粒瞬转293T细胞,Western blot检测到细胞内LHBs蛋白的表达,并有自切外泌信号肽迹象;ELISA检测细胞上清中LHBs蛋白成功外泌。BALB/c小鼠免疫试验显示,pHL-sec-LHBs质粒成功诱发小鼠针对LHBs蛋白特异性抗体产生。结论成功构建pHL-sec-LHBs重组质粒作为乙肝病毒DNA疫苗,该疫苗对BALB/c小鼠中具有良好的免疫原性。; 石文刚徐瑞贤刘敏刘敏Faisal Mahmood宋玉竹韩芹芹夏雪山张金阳; 关键词：乙肝病毒 DNA疫苗免疫原性

丙型肝炎炎症发生与细胞信号通路异常被引量：1: 2016年; 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是引起慢性丙型肝炎的直接原因,炎症的持续发生会导致肝纤维化、硬化甚至是肝癌的出现。炎症发生通常与细胞信号通路异常相关,病毒感染后病毒蛋白干扰宿主细胞正常的信号转导途径,使得促炎和炎症相关分子异常表达,导致炎症的发生。了解HCV感染后炎症发生的分子机制将有助于防止丙型肝炎炎症的恶化,为临床抗病毒治疗提供参考。; 刘阳冯悦翁长江夏雪山; 关键词：丙型肝炎炎症分子机制信号转导

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昆明理工大学生命科学与技术学院云南省分子医学研究中心

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