国家自然科学基金(31270135)
- 作品数：14 被引量：22H指数：3
- 相关作者：汤斌李松张庆庆汤文晶孟庆婷更多>>
- 相关机构：安徽工程大学安徽省工程技术研究中心江南大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金安徽省自然科学基金更多>>
- 相关领域：轻工技术与工程生物学化学工程更多>>
- 匍枝根霉淀粉发酵产纤维素酶的条件研究被引量：3
- 2016年
- 以匍枝根霉TP-02(Rhizopus stolonifer TP-02)为出发菌株,首次利用淀粉水解液为主要碳源,快速合成纤维素酶。从碳源、氮源、培养温度、初始p H、装液量和接种量等方面研究该菌株的产酶条件。获得最佳培养基和培养条件为:10%淀粉水解液,麸皮浸出汁5%,NH_4Cl 0.5%,KH_2PO_40.5%,MgSO_4·7H_2O 0.4%,CaCl_20.4%,酵母粉0.6%;发酵温度30℃,装液量80 m L/(250 m L),初始p H 5.0,接种量8%。通过摇瓶实验优化培养基和培养条件后,获得滤纸酶活为9.66 IU/m L。研究中进一步利用该培养基在5 L发酵罐中发酵至60 h时酶活达到最大值,其中滤纸酶活、外切酶活、内切酶活和β-葡萄糖苷酶分别为16.51、15.39、11.48和6.17 IU/m L。与以往纤维素类物质为碳源发酵产纤维素酶相比,淀粉水解液发酵获得的纤维素酶酶系组成有了较大的变化,特别是关键的外切酶活有了大幅度提高,而发酵时间缩短了将近1倍。
- 周若飞汤斌李松阚清华
- 关键词：匍枝根霉发酵纤维素酶
- 匍枝根霉β-葡糖苷酶的分离纯化及其受产物抑制分析
- 2016年
- 对匍枝根霉β-葡糖苷酶进行了纯化并研究了葡萄糖、甘露糖、山梨醇和甘露醇对该酶的抑制作用,结果发现,66.7 mmol/L的葡萄糖和88.9 mmol/L的甘露糖可完全抑制一定酶活力单位的β-葡糖苷酶活力(0.76IU),而山梨醇和甘露醇对β-葡糖苷酶的催化活力没有影响。分析结构发现,葡萄糖和山梨糖、甘露糖和甘露醇结构差异仅在醛基位置,通过Molegro Virtual Docker(MVD)软件模拟并分析葡萄糖、山梨醇和纤维二糖与β-葡糖苷酶的对接模型,发现含有醛基的葡萄糖与纤维二糖在酶的结合区存在两处竞争性结合位点(Asp244和Asn242),且两者在该酶活性中心内的全部结合位点上均处于竞争性关系,其中葡萄糖的醛基在与多个活性位点结合过程中起主导作用;而不含醛基的山梨醇与纤维二糖在该酶的催化中心及外围均不存在竞争性关系,由此推测可能是葡萄糖分子中的醛基在β-葡糖苷酶受产物抑制的过程中起到了关键性的作用。
- 孙全霞汤斌李松
- 关键词：分离纯化醛基
- 匍枝根霉纤维素酶高产菌株的诱变选育及发酵优化被引量：1
- 2018年
- 为提高纤维素酶产量,以匍枝根霉TP-02为出发菌株,通过诱变选育纤维素酶高产突变株,并研究碳源、氮源以及氨基酸等物质对菌株产酶能力的影响.经紫外和甲基磺酸乙酯复合诱变后筛选得到一株高产菌株TZ-03,其滤纸酶活(FPA)为4.96IU/mL,较TP-02提高了37.8%.优化后最佳发酵培养基为:微晶纤维素20g/L,鱼粉蛋白胨10g/L,麸皮浸出汁2.5%,CaCl_22g/L,MgSO_4·7H_2O 4g/L,KH_2PO_43g/L,谷氨酰胺1g/L,PEG-4000 0.25g/L,Tween 80 200μL/L,微量元素液1mL/L.此条件下TZ-03的FPA酶活高达11.58IU/mL.通过对发酵过程中溶氧、pH和补料条件的控制,进行10L发酵罐放大实验,最终使该突变株的FPA酶活在84h达到峰值21.32IU/mL,与摇瓶发酵相比提高了89.8%.β-葡萄糖苷酶(BG)、内切酶(EG)和外切酶(CBH)的酶活峰值分别为41.0IU/mL、26.76IU/mL和16.94IU/mL.通过诱变及发酵优化成功提高了纤维素酶产量,为纤维素酶的工业化应用奠定了一定的基础.
- 郑贤金汤斌
- 关键词：匍枝根霉纤维素酶诱变选育发酵优化
- 匍枝根霉纤维二糖合成酶胞内糖基供体的初探及结构功能研究
- 2018年
- 纤维二糖可有效诱导丝状真菌产纤维素酶,前期研究表明匍枝根霉Rhizopus stolonifer TP-02具有纤维二糖合成酶（CBS）,可以尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）为糖基供体合成纤维二糖,从而开启纤维素酶的自诱导合成途径。为研究R.stolonifer中纤维二糖的胞内合成途径,通过重叠PCR在GDP-葡糖焦磷酸化酶基因ggp中引入硫胺吡啶抗性基因ptr A,分别转化原菌TP-02和△ugp突变株,构建△ggp和△ugp/△ggp突变株。利用液质联用（LC-MS）检测突变株的胞内糖组分,发现ggp的缺失对胞内纤维二糖合成的影响较弱,但同时缺失ugp则将直接导致二糖合成受阻。RT-q PCR结果显示△ggp突变株中纤维素酶基因转录水平较原株TP-02下调20%左右,而△ugp/△ggp突变株中被测基因的转录水平则出现了高达80%左右的下调。同时对突变株纤维素酶表达水平进行研究,发现△ugp/△ggp突变株中几乎检测不到纤维素酶活力。结果显示,UDPG为R.stolonifer胞内合成纤维二糖的主要糖基供体,而GDPG可能是UDPG的替代物,在UDPG不足时维持胞内二糖合成。此外,利用生物信息学方法对CBS结构功能深入分析,经丙氨酸扫描确定其合成纤维二糖的关键作用残基为Asp210和Asp300,为后续进一步研究及理性改造提供方向和理论依据。
- 张莹莹汤斌堵国成
- 关键词：纤维二糖纤维素酶匍枝根霉
- 色氨酸W129在匍枝根霉内切葡聚糖酶EGⅡ降解纤维素过程中的作用
- 2015年
- 通过对匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)内切葡聚糖酶EGII进行结构功能分析,发现其活性中心入口处的色氨酸W129在水解纤维素的过程中起着关键作用。对该位点进行定点突变(W129A),并研究了它对EGII和催化区(CD)的影响。经原核表达及纯化,获得目的蛋白EGII-W129A和CD-W129A。酶学特性研究结果显示,重组蛋白的比酶活、kcat和kcat/Km均低于EGII和CD,比酶活分别下降了23.8%和35.7%,同时Km值均有所提高。W129A导致酶与底物的亲和力和催化效率下降,使酶活力降低的原因主要是其减弱了活性中心入口处纤维素链的"载入"效率,即Trp129在EGII水解纤维素过程中起到加载纤维素链的重要作用。
- 韦兰芳汤斌李松周若飞
- 关键词：匍枝根霉内切葡聚糖酶色氨酸定点突变
- 匍枝根霉cbh2基因的克隆表达与结构分析
- 2015年
- 采用反向PCR技术从匍枝根霉中克隆cbh2基因,该基因编码440个氨基酸的蛋白质。利用DS2.5软件进行同源模拟和建立分子动力学模型,研究cbh2催化纤维六糖水解过程中结合区（CBM）上的关键位点,催化区（CD）上催化隧道关键位点的相互依赖作用,水解β-1,4糖苷键,生成纤维二糖。把cbh2基因与p ET22-b（＋）载体连接,实现了在E.coli BL21（DE3）中原核表达。通过镍柱层析、DEAE FF层析和G-75层析三步纯化法获得46 k Da的酶蛋白,比活力为4.67 IU/mg。纯化的重组酶具有高水平的催化活性,对微晶纤维素具有较好的水解特性,CBHII酶的Km为7.358（mg/m L）。研究CBHII酶的基本特性,其最适反应温度为50℃,最适反应p H为5.0,CBHII酶在p H 4～7下具有较宽的稳定性,在65℃以下热稳定性较好,在催化过程中保持较高的活力。
- 张庆庆谢志皓李松孙全霞汤斌
- 关键词：匍枝根霉纤维二糖水解酶克隆表达纯化
- 重组毕赤酵母产匍枝根霉内切葡聚糖酶Ⅱ的分离纯化及其酶学性质研究
- 2015年
- 将来源于匍枝根霉的endoglucanaseⅡ(egⅡ)在毕赤酵母中实现异源表达,对构建完成的重组毕赤酵母进行高密度发酵,制备目标酶蛋白.发酵液经Ni柱分离纯化,得到分子量大小约为38kDa,比酶活为37.8IU/mg的蛋白.酶学性质研究表明:该酶最适反应温度为55℃,最适反应pH为4.8;Mn2+、Zn2+、Fe2+对egⅡ的酶活力有一定的激活作用,Cu2+对egⅡ酶活有抑制作用,Mg2+、Co2+、Na+和K+等离子对该酶的催化活力没有明显影响;该酶以CMC-Na为底物时其反应米氏常数为2.04mg/ml.
- 程伟汤斌李松
- 关键词：匍枝根霉内切葡聚糖酶分离纯化酶学性质
- ARTP诱变筛选匍枝根霉提高木聚糖酶活力研究被引量：1
- 2016年
- 以匍枝根霉亚种点头根霉TP-02为原始菌株,利用ARTP诱变系统进行诱变处理.通过透明圈法进行初筛和摇瓶发酵进行复筛,获得一株遗传性状稳定的高产木聚糖酶诱变菌株TZD-01,木聚糖酶活力达到280.81U/mL,为原始菌株的2.7倍.通过光学显微镜和扫描电子显微镜观察诱变菌株与原始菌株微结构特征变化,ARTP诱变处理可引起菌株形态特征发生改变.诱变菌株的菌落形态不规则,颜色为黑褐色,比原始菌株偏深;菌丝直径变大,形态更饱满;孢子形态规则更接近圆形,诱变筛选菌株的生长速度比原始菌株更快.
- 党同学张庆庆汤文晶程亚运
- 关键词：匍枝根霉木聚糖酶扫描电子显微镜
- cbh1重组菌的构建、产酶条件及酶特性分析被引量：1
- 2015年
- 从匍枝根霉TP-02中克隆得到cbh1的c DNA,序列测定分析表明,该基因编码526个氨基酸的蛋白质。通过DS2.5同源模拟分析,CBHI酶的活性部位是一个＂桶状＂的隧道结构。将cbh1基因的c DNA序列克隆到大肠杆菌表达载体p ET22b（＋）中,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达。采用两步层析法对重组的CBHI蛋白进行纯化,对纯酶的特性进行分析。结果表明：在异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导终浓度为0.5 mmol/L,诱导温度为20℃,诱导时间为14 h,经过纯化后获得比活力为3.57 IU/mg。重组酶的最适反应温度和p H分别为55℃和5.5,在p H4.5~6.5的范围内稳定性较好,Fe3＋和Co2＋对其具有较强的激活作用;以微晶纤维素为底物,Km值为6.1 mg·m L-1。
- 谢志皓张庆庆汤斌李松党同学
- 关键词：匍枝根霉纯化酶学性质
- 碱性β-甘露聚糖酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件优化被引量：9
- 2019年
- 为获得具有潜在工业应用价值的碱性β-甘露聚糖酶产生菌株,从自然土样中分离得到1株产酶性状较好的碱性细菌,经形态学和分子生物学分析鉴定为科氏芽孢杆菌(Bacillus cohnii)。粗酶性质研究显示,该菌株所产β-甘露聚糖酶最适作用温度和pH分别在55℃和9.5。通过单因素和正交设计试验优化后,该菌株摇瓶发酵至36 h时,产酶水平为345 U/L,是优化前产酶水平的4.3倍。研究结果为碱性β-甘露聚糖酶的放大发酵奠定了基础,为碱性β-甘露聚糖酶编码基因的克隆及异源表达等相关研究提供了良好的菌种资源。
- 汤文晶李松马忠宝杨倩汤斌
- 关键词：Β-甘露聚糖酶分子鉴定
