国家自然科学基金(21176103)
- 作品数：9 被引量：6H指数：1
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- 迭代饱和突变提高Bacillus cereus胺脱氢酶对苯乙酮还原的催化效率
- 2020年
- 基于同源建模建立了Bacillus cereus胺脱氢酶(Bc AmDH)的三维结构,采用半理性设计方法,对底物结合口袋附近的8个氨基酸残基(L42,G43,M67,A115,E116,T136,V293和V296)分别进行单点饱和突变,通过显色法筛选出3个正向突变位点(116,136和293).进一步采用迭代饱和突变策略对这3个正向位点进行组合突变,获得最优突变株V293A/E116V/T136S,其对苯乙酮还原反应的催化效率达到2.54 L·min-1·mmol-1,比Bc AmDH提高了719%;与Bc AmDH相比,最优突变株在催化苯乙酮的不对称还原反应时,底物浓度由100 mmol/L提高至300 mmol/L,转化率由42.1%提高至80.2%.分子对接结果表明,突变株底物结合口袋的位阻减小和底物进出通道的扩大是提高催化效率的主要原因.
- 吴涛穆晓清聂尧聂尧
- 关键词：苯乙酮
- 关键酶基因转录水平对重组大肠杆菌合成NAD;的影响被引量：1
- 2021年
- 【目的】烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide)是生物体内一种重要的辅因子,其细胞内含量对于NAD;依赖型氧化还原反应和有关生化合成代谢具有重要意义。为强化辅因子合成,本文通过不同诱导条件下关键酶基因转录水平与产物合成水平的相关性分析,利用增加正向关键酶基因拷贝数策略提高胞内氧化型辅酶NAD^(+)的浓度。【方法】以实验室前期构建的大肠杆菌NA016为出发菌株,分别从诱导温度、诱导剂浓度、诱导时机三个方面进行了诱导条件的优化,并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对代谢改造中的有关过表达基因进行了转录水平分析,确定了NAD^(+);量与这些过表达基因转录水平之间的相关性,增加对NAD;合成代谢具有正向作用的基因拷贝数以进一步提高胞内NAD^(+)水平。【结果】通过诱导条件优化实验确定菌株NA016的最适诱导温度,在诱导时机为OD600达到0.6时加入0.8mmol/L的IPTG可使胞内NAD^(+)含量提高35.37%;转录水平方面分析发现基因nadE和pncB的表达对NAD^(+)的合成具有正向调节作用。进一步增加菌株NA016中关键酶基因nadE和pncB的拷贝数可使辅酶含量再次提高22.46%,最高可达41.66μmol/g DCW。【结论】优化诱导条件和增加关键酶基因拷贝数可以提高氧化型辅酶NAD^(+)的含量,这为促进大肠杆菌胞内NAD^(+)合成的研究提供借鉴意义。
- 穆晓清杨琳琰徐岩
- 关键词：大肠杆菌烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转录水平
- 疏水离子液体中生物不对称还原制备手性醇
- 2015年
- 针对近平滑假丝酵母全细胞不对称还原2-羟基苯乙酮制备光学纯(R)-苯基乙二醇反应中底物的质量浓度、产量及质量平衡低的问题,运用多相萃取生物转化的原理,比较不同非水介质对不对称还原反应效率的影响,构建具有良好生物相容性和高质量平衡的水/疏水离子液体1-丁基-3-乙基咪唑六氟磷酸盐([BEIM]PF6)双相反应体系。考察该体系下辅助底物种类、辅助底物用量、底物质量浓度、催化剂用量、离子液体比例、p H和反应温度对生物催化反应的影响,通过正交试验设计和响应面法优化不对称还原2-羟基苯乙酮的反应条件,在最优反应条件下,产物质量浓度、产率和质量平衡得率分别达到15.35 g/L、76.8%和84.3%,产物的对映消旋值(e.e.值)大于99.9%。
- 宋洁穆晓清王栋徐岩
- 关键词：全细胞离子液体
- 一锅法合成去甲基麻黄素被引量：1
- 2021年
- 以廉价底物苯甲醛、丙酮酸和NH_4Cl为原料,通过级联乙醛羟酸合成酶(ASAHⅠ)催化缩合反应和胺脱氢酶(BbAmDH)催化还原胺化反应,构建了去甲基麻黄素的生物合成新途径.通过优化分步法和一锅法的反应条件,使苯甲醛转化率分别达到99%和83%.采用一锅法,利用底物补料策略,有效解除了ASAHⅠ的底物和产物抑制作用,批次反应的苯甲醛浓度从40 mmol/L提高到100 mmol/L,苯甲醛转化率从83%提高到90%,苯甲醛的时空转化率提高了2.7倍.
- 罗磊穆晓清吴涛聂尧聂尧
- 关键词：一锅法生物转化
- 生物-化学法合成黑色素前体5,6-二羟基吲哚被引量：1
- 2022年
- 研究了偶联Saccharomyces cerevisiae BY4741/pYX212-TYR催化L-多巴(L-Dopa)合成多巴色素(DC)的生物氧化步骤和DC还原合成5,6-二羟基吲哚(DHI)化学步骤,实现了DHI的生物-化学合成.通过优化生物氧化步骤的反应条件及供氧策略等因素,使L-Dopa的转化率提升至94.75%;通过优化化学还原步骤反应条件及化学助剂,使DHI的产率提高到90.03%.产物的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)分析结果表明,反应体系中存在DHI可溶性低聚物.
- 金睿明穆晓清徐岩
- 关键词：酪氨酸酶
- 亮氨酸脱氢酶与葡萄糖脱氢酶高效共表达制备L-叔亮氨酸被引量：1
- 2016年
- 【目的】通过不同双基因共表达策略对亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌中表达影响的研究,获得具有高辅酶再生效率的双酶共表达重组生物催化剂,实现L-叔亮氨酸"一锅法"高效不对称合成。【方法】以来自于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的亮氨酸脱氢酶(LDH)和来自芽孢菌属(Bacillus sp.)的葡萄糖脱氢酶(GDH)为模板,考察单质粒共表达,双质粒共表达和融合表达等3种共表达策略对重组细胞中亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶活的影响,比较不同酶活比例和不同催化剂形式对三甲基丙酮酸不对称还原制备L-叔亮氨酸效率的影响。【结果】研究发现不同共表达策略对亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的影响存在明显差异。亮氨酸脱氢酶在不同策略下均能够正常表达,而葡萄糖脱氢酶在融合表达时没有活力,当C端含有组氨酸标签时,表达蛋白活性低。通过表达优化,获得3株亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶高效表达且具有不同酶活比例的重组菌。比较粗酶液和全细胞形式下的催化效率,发现酶活比例及催化剂形式对不对称还原反应效率具有重要影响。确定单质粒串联表达C端不含His标签重组菌E.coli BL21/p ET28a-L-SD-AS-G为最佳催化剂,以粗酶液进行转化时,完全转化0.5 mol/L底物所需菌体量为15 g/L,辅酶量为0.1 mmol/L。【结论】采用单质粒共表达策略,成功构建出1株具有较高亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶活性的重组菌,实现高效催化TMP合成L-Tle。
- 杨兴龙穆晓清聂尧徐岩
- 关键词：葡萄糖脱氢酶C端
- 近平滑假丝酵母催化立体异构反应中试放大研究
- 2012年
- 近平滑假丝酵母催化立体异构反应制备光学纯手性芳基醇立体选择性和转化效率高,具有良好工业化放大价值。本研究以Candida parapsilosis CCTCC M203011催化外消旋苯基乙二醇立体异构反应制备(S)-苯基乙二醇为对象考察中试规模下生物催化剂制备和生物转化反应过程。研究发现,按照等通风量和等搅拌桨末端速度为基准进行生物催化剂制备规模放大后,菌体浓度提高至65 g/L,但发酵终了pH下降为2.7,异常产酸,并丧失催化特性。在发酵产酸分析基础上,运用发酵培养基组成、恒pH发酵、发酵溶氧控制等策略,在最优条件下,实现了150 L罐催化剂的高效制备,并成功实现50 L反应釜的转化放大,产物(S)-苯基乙二醇e.e.>99.4%,产率>95.2%。
- 穆晓清许敏伟徐岩
- 关键词：碳氮比近平滑假丝酵母苯基乙二醇
- 水/有机溶剂双相酶偶联体系不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯
- 2013年
- 酶分子经济性是评估单位酶催化剂分子催化效率的常数,其定义为单位酶活力催化的时空产率,即比时空产率。本研究以模式底物4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)为研究目标,系统考察了底、产物对参与催化反应的羰基还原酶(CR2)及葡萄糖脱氢酶(GDH)各自酶活力的毒害及抑制作用,对此从17种有机溶剂中筛选较适合该体系的有机溶剂-邻苯二甲酸二丁酯,进一步确定水/有机双相最佳反应比例为1:1。在此基础上,采用先单水相后双相的反应形式,结合底物补料策略将底物浓度提高至300 mmol/L,反应6 h后产物得率高达97.4%,光学纯度大于99.9%e.e.,有机相中产物浓度达到475 mmol/L,比时空产率达到16.2 mmol/L·h·U,相比于所报道的酶偶联体系,本研究构建的双相体系具有较好的酶分子经济性。
- 陈星星穆晓清徐岩
- 关键词：羰基还原酶
- 重组大肠杆菌产普鲁兰酶发酵条件优化被引量：2
- 2015年
- 在7L发酵罐规模，利用自诱导培养方式，对重组大肠杆菌产普鲁兰酶发酵条件进行优化研究，主要考察了发酵过程中控制溶解氧浓度、pH和采用补料策略对菌体生长和普鲁兰酶表达的影响。结果表明，最佳发酵培养条件：溶氧浓度维持在20％-30％；pH保持在7．60；第9h时，以0．8g／（L·h）的速度流加甘油；在20h，以0．2g／（L·h）的速度流加乳糖。此条件下，重组菌的细胞浓度OD600nm从12．58上升到42．25，提高了3．36倍；普鲁兰酶酶活力从356U／ml上升到1200U／ml，提高了3．37倍。
- 王小兰穆晓清徐岩聂尧
- 关键词：普鲁兰酶发酵优化分批补料发酵
