国家高技术研究发展计划(2012AA022205)
- 作品数：8 被引量：33H指数：3
- 相关作者：何冰芳陈利娟吴斌韩双艳林影更多>>
- 相关机构：南京工业大学华南理工大学天津科技大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程石油与天然气工程化学工程更多>>
- 蜡样芽胞杆菌蛋白酶的克隆及在枯草芽胞杆菌系统中的高效表达被引量：2
- 2015年
- 基于来源于Bacillus cereus WQ9-2的耐有机溶剂蛋白酶WQ的液相色谱-双质谱(LC-MS-MS)分析结果,设计引物,克隆耐有机溶剂蛋白酶WQ的基因,测序分析表明该蛋白酶的开放阅读框(ORF)大小为1 701 bp,编码566个氨基酸,其中含有信号肽(28个氨基酸)、前肽(220个氨基酸)及成熟肽序列(含954 bp编码318个氨基酸),相对分子质量约为3.7×104。将不带自身信号肽的蛋白酶基因apr WQ插入穿梭质粒p MA5中,构建了表达载体p MA5/apr WQ。该表达载体导入枯草芽胞杆菌WB600中获得阳性重组子WB600-p MA5/apr WQ,通过优化培养基成分以及培养条件,重组子发酵产蛋白酶体积酶活达到17 400 U/m L,约为高产野生菌产酶量的5倍。重组蛋白酶在多种有机溶剂(体积分数为50%)中表现出了良好的耐受性,验证了重组菌表达的蛋白酶与来源于B.cereus WQ9-2的耐有机溶剂蛋白酶性质一致,该耐有机溶剂蛋白酶的高效表达为进一步发挥其高效生物催化作用等实际应用奠定了基础。
- 承龙飞朱富成刘可可何冰芳
- 关键词：枯草芽胞杆菌发酵优化
- 耐热普鲁兰酶CBM68结构域中关键位点对其酶学性质的影响被引量：2
- 2016年
- 通过对Anoxybacillus sp.LM18-11来源的耐热普鲁兰酶(Pul A)与麦芽三糖共结晶的晶体结构分析,在新命名的底物结合域CBM68中预测出4个与底物结合有关的氨基酸位点(Y14、D16、K62和R96),分别将4个氨基酸位点突变为丙氨酸,得到突变体Pul A^(Y14A)、Pul A^(D16A)、Pul A^(K62A)和Pul A^(R96A)。其中,突变酶Pul A^(Y14A)和Pul A^(R96A)的底物结合力及催化效率与野生酶Pul A相比均有明显降低,其K_m值分别比Pul A提高了4.2倍和2.5倍,k_(cat)/K_m分别为Pul A的29%和37%。同时,Pul A^(Y14A)和Pul A^(R96A)的最适作用温度均降低了10℃,Pul A^(R96A)的最适作用p H也降低了0.5个单位。说明Y14和R96是CBM68结构域中的关键氨基酸位点,这两个位点的发现为进一步探究CBM68结构域的作用机制奠定了基础。
- 申莹莹郑宏臣李树芳付晓平徐健勇宋诙
- 关键词：定点突变
- 来源于铜绿假单胞杆菌(Pseudomon asaeruginosa)所产蛋白酶PT121克隆表达及其在小肽合成上的应用被引量：2
- 2015年
- 【目的】基于前期筛选到的P.aeruginosa PT121所产有机溶剂耐受性蛋白酶,本研究对该蛋白酶进行克隆表达,研究了重组蛋白的酶学性质及小肽合成上的应用。【方法】参考文献中报道的相似蛋白酶pseudolysin设计引物从菌株PT121基因组中克隆到耐有机溶剂蛋白酶PT121基因las B。构建诱导表达重组质粒p ET22b-las B,于大肠杆菌中进行表达。考察蛋白酶PT121酶学性质及小肽合成上的应用。【结果】序列分析表明las B基因编码信号肽、前肽及成熟肽3个部分,成熟肽部分含有301个氨基酸,分子量约33 k Da,属于金属蛋白酶M4家族。通过破碎条件优化,一步法制备得到较为纯净的重组蛋白酶PT121,其比活力达7700 U/mg,该酶呈现了较高的热稳定性,p H稳定性及溶剂耐受性,与野生菌P.aeruginosa PT121所产蛋白酶性质一致。在50%DMSO体系中高效催化合成了多种小肽,其中阿斯巴甜前体(Cbz-Asp-Phe-NH2)产率高达91%。【结论】蛋白酶PT121基因在大肠杆菌中克隆表达为进一步研究相关催化机理及分子改造奠定了基础。
- 朱富成庄宇何冰芳
- 关键词：异源表达有机溶剂耐受性
- 酵母表面展示脂肪酶合成己二酸二异辛酯被引量：6
- 2013年
- 展示酶的酵母细胞既具有固定化酶的优点,又有制备简单、成本较低的特点。采用表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)的毕赤酵母细胞催化合成己二酸二异辛酯(Diisooctyladipate,DIOA),对该反应体系进行优化,并实现了初步工艺放大制备。经条件优化后,在10 mL反应体系中,DIOA的产率可达85.0%。该工艺放大到200 mL反应体系时,DIOA产率可达97.8%。经减压蒸馏,DIOA纯度可达到98.2%。该酵母表面展示脂肪酶在合成绿色润滑油己二酸二异辛酯中具有良好应用前景。
- 张娜金子林影郑穗平韩双艳
- 关键词：酵母表面展示己二酸二异辛酯绿色润滑油
- ARTP诱变选育鼠李糖脂高产菌及鼠李糖脂促进枯草芽孢杆菌产纤维素酶的研究被引量：6
- 2015年
- 旨在选育鼠李糖脂高产菌株,以实验室筛选的产鼠李糖脂的Pseudomonas aeruginosa C3为出发菌株进行常压室温等离子体诱变(ARTP),选育出一株高产突变株Pseudomonas aeruginosa SC-11,产量比出发菌株提高了74.1%。进一步对产鼠李糖脂的摇瓶发酵培养基和发酵条件进行了优化,优化后的鼠李糖脂产量达42 g/L,底物转化率达到0.7 g/g底物。添加0.01%鼠李糖脂到Bacillus subtilis CL产羧甲基纤维素酶与木聚糖酶的培养基中,羧甲基纤维素酶活与木聚糖酶活分别提高12.9%和18.3%。研究表明,鼠李糖脂通过增加细胞通透性来提高胞外酶产量。
- 陈利娟吴斌何冰芳
- 关键词：鼠李糖脂羧甲基纤维素酶木聚糖酶
- 脂肪酶YCJ01拆分对位取代α-苯乙醇被引量：2
- 2015年
- 利用脂肪酶YCJ01催化拆分对位取代α-苯乙醇衍生物。以异丙醚为反应介质,采用乙酸乙烯酯作为酰基供体,对180 mmol/L的1-(4-甲基苯基)乙醇进行选择性酯化,脂肪酶粗酶粉添加量为5 g/L,50℃反应21 h后,底物转化率可达49.96%,对映体过量值e.e.s、e.e.p值分别为97.1%和97.2%,对映体选择性E>200;同样,对1-(4-甲氧基苯基)乙醇进行选择性酯化,酰基供体为丁酸乙烯酯,底物浓度150 mmol/L,脂肪酶粗酶粉添加量为2.5g/L,30℃反应12 h后,底物转化率为49.8%,e.e.s、e.e.p值分别为97.7%和98.4%,对映体选择性E>200,显示了很好的手性拆分效果。
- 秦燕李文豪汪斌何冰芳
- 关键词：手性拆分Α-苯乙醇
- 抗辐射不动杆菌碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达被引量：3
- 2013年
- 本研究将来自抗辐射不动杆菌CMC-1的碱性脂肪酶基因去掉信号肽,经密码子优化及全基因合成后克隆到pPICZαA载体,构建了重组质粒pPICZαA-ARL,质粒线性化后转化毕赤酵母X33,筛选得到分泌表达碱性脂肪酶的重组毕赤酵母X33/pPICZαA-ARL。摇瓶发酵液上清酶活最高达65 U/mL,初步研究了该脂肪酶的酶学性质,其最适作用温度为50℃,最适pH为9.0,最适底物是对硝基苯酚辛酸酯。
- 韩双艳赵小兰林小琼郑穗平林影
- 关键词：碱性脂肪酶密码子优化毕赤酵母
- ARTP诱变选育高温蛋白酶高产菌株及其酶学性质研究被引量：11
- 2015年
- 以高温环境土样中筛选的产高温蛋白酶菌为出发菌株,利用常压室温等离子体诱变技术选育出一株高产突变株Bacillus licheniformis TP1-5,产酶活力达到33200U/m L,为出发菌株的1.56倍。通过乙醇沉淀和阴离子交换层析两步纯化,获得电泳纯的高温蛋白酶。酶学性质研究表明,该蛋白酶为高温碱性丝氨酸蛋白酶,酶的最适p H为10.0,最适反应温度为60℃,具有较好的p H稳定性和热稳定性;对离子型和非离子型表面活性剂均具有很高的耐受性,为进一步开发应用奠定了基础。
- 薛刚陈利娟吴斌何冰芳
- 关键词：高温蛋白酶诱变选育纯化酶学性质
