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腾冲嗜热厌氧菌耐热解旋酶Tte-uvrD的克隆表达及粗酶的初步应用: 2014年; 以腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)基因组DNA为模版,通过PCR克隆编码解旋酶Tte-uvrD的基因tte-uvrd,将该基因插入原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达载体pET-32a(+)-tte-uvrd,转入E.coli BL21中,经蓝白斑筛选和双酶切法筛选阳性重组转化子,挑取测序正确的单个阳性菌落,在IPTG诱导下表达出重组蛋白Tte-uvrD。诱导后的菌体经超声破碎和离心,上清液用硫酸铵沉淀法初步纯化,透析除盐,冻干复溶后得到粗酶液。用tHDA反应来验证Tte-uvrD粗酶液的活性,比较不同储存温度下粗酶液酶活保持的时间,并比较-20℃下储存两个月的粗酶液与商品化纯酶的tHDA反应灵敏度。结果表明,用本研究建立的克隆方法可成功克隆出耐热解旋酶TteuvrD,其粗酶液能用于tHDA反应,说明粗酶液具有解旋活性;粗酶液在-20℃下第80d酶活仍能保持稳定,4℃下则只能保持酶活约一周;-20℃下储存两个月的粗酶液能达到与商品化纯酶相当的灵敏度。; 章丽余以刚黄秀丽肖性龙; 关键词：腾冲嗜热厌氧菌

高分辨率熔解曲线分析法检测食源性副溶血性弧菌: 2013年; 为建立一种快速鉴定副溶血性弧菌的HRM(高分辨率熔解曲线)real-time PCR法,以tox R为靶基因,结合特异性引物,通过优化反应体系及条件,进行特异性、敏感性及重复性评价,并初步应用于90份送检的鲜活海产品样本的检测。特异性试验表明,该方法能选择性检测副溶血弧菌,Tm值为76.64±0.57℃;而与创伤弧菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌等多种海产品中常见的食源性病原菌没有交叉反应。灵敏度试验表明,该方法最少可检测tox R重组质粒的浓度为3.50×102copies/mL。重复性试验表明,同一样品于试验内及试验间的平均Tm值分别为76.53±0.35℃和76.74±0.52℃,变异系数分别为0.56±0.42%和1.11±0.73%。对90份鲜活海产品样本的检测证实该法可使阳性检出率从国标法的14.44%提高至18.89%。本研究所建立的副溶血性弧菌HRM real-time PCR法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能应用于食品样本的检测,具有很好的研究价值和应用前景。; 章丽余以刚赖富饶吴晖杨锡洪肖性龙; 关键词：副溶血性弧菌高分辨率熔解曲线实时PCR 荧光

荧光PCR高分辨率熔解曲线分析法检测食源性金黄色葡萄球菌被引量：1: 2014年; 以sa442为靶基因,结合特异性引物,建立了一种快速检测鉴定食品中常见的金黄色葡萄球菌的HRM(高分辨率熔解曲线)real-time PCR法,对该法进行特异性验证,敏感性分析及重复性评价,并实现了其在人工染菌鸡肉样本检测的初步应用。结果表明,该方法具有较强的特异性,对8株金黄色葡萄球菌目标菌株均产生特异性溶解曲线,Tm值为(77.34±0.287)℃,而沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157等8种肉产品中常见的食源性非目标病原菌均不产生扩增曲线;灵敏度高,该法对阳性重组质粒PMD18-sa442的检测限为2.00×102 copies/mL;重复性强,同一样品于试验内及试验间的变异系数分别为(0.76±0.52)%和(1.34±0.45)%;且该法可初步应用于人工染菌鸡肉样(染菌量5、10、20 cfu/25 g样品匀浆)的检测。所建立的金黄色葡萄球菌HRM real-time PCR法具有特异性好、灵敏度高、重复性强的特点,能应用于食品样本的检测,为金黄色葡萄球菌的快速检测提供了新的方法。; 黄秀丽章丽奉夏平肖性龙余以刚; 关键词：金黄色葡萄球菌高分辨率熔解曲线荧光PCR

沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌共增菌培养基的研制被引量：7: 2013年; 为研制出一种能够同时选择性富集沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的培养基,对多种抑制剂和促进剂进行筛选。实验优化出的最佳培养基配方为:胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨5g、磷酸二氢钾2.5g、葡萄糖2.5g、氯化钠35g、氯化锂0.5g、牛胆盐0.1g、甘露醇2g、亚碲酸钾0.3mg,蒸馏水1000mL。沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌等目标细菌在此共增菌培养基中均能快速生长,以103CFU/mL为初始菌浓,18h后菌浓能达到107CFU/mL,而非目标菌在此肉汤中的生长受到抑制。结果表明,此培养基可以用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的选择性共增菌。; 王永志余以刚黄秀丽肖性龙吴晖; 关键词：沙门氏菌志贺氏菌金黄色葡萄球菌

单增李斯特菌非可培养状态的诱导与PMA-qPCR检测被引量：9: 2014年; 在9%(w/v)NaCl条件下,通过温度、pH两种因素诱导一株单增李斯特菌进入"活的非可培养"(viable but non-cuturable,VBNC)状态。通过LIVE/DEAD Baclight活菌检测试剂盒检测细菌总数与活菌数,比较单增李斯特菌状态及数量的差异与变化。结果显示,在2℃、pH6.0条件下单增李斯特菌活菌全部进入VBNC状态。用PMA-qPCR对经诱导的四份菌液进行检测,结果表明该方法能快速、准确地测出死菌背景下的活的单增李斯特菌。; 黄韵余以刚黄秀丽李晓凤肖性龙吴晖; 关键词：VBNC PMA 单增李斯特菌活菌

猪瘟病毒野生株和疫苗株荧光RT-PCR鉴别方法的建立被引量：1: 2013年; 为了建立猪瘟病毒野生株和疫苗株荧光RT-PCR鉴别方法,设计了1对通用引物和2条特异性MGB探针。此外,为防止假阴性结果出现,制备了假病毒用于全程检测监控。测试了本方法的特异性,灵敏度,重复性等技术指标。结果显示,在选定的猪病相关病毒组内特异性符合率达100%;对野毒株和疫苗株的检测灵敏度分别达到1TCID50/mL和0.1 TCID50/mL;重复性实验表明组内和组间变异系数均在0.7-2.2%之间。临床比对试验结果显示,荧光RT-PCR对猪肉、脾脏和血液病料进行猪瘟野毒检测的阳性率分别为66.7%、60.0%、77.8%,而传统方法的阳性率分别为52.4%、40.0%、50.0%;检出率比传统方法要高。此外,临床试验样本中,PCR抑制物在猪肉、脾脏和血液病料中存在的比例分别为9.5%、10.0%和5.6%,显示了假病毒作为内标对PCR检测监控的重要作用。; 余以刚黄韵陶文扬章丽吴晖肖性龙赖富饶杨锡洪; 关键词：猪瘟病毒荧光RT-PCR 假病毒

PMA-qPCR方法快速检测活性E.coli O157:H7被引量：8: 2012年; 建立将叠氮溴化丙锭(PMA)与定量PCR(qPCR)技术结合,用于检测热灭活菌背景条件下的大肠杆菌活菌的方法。结果表明:5min以上的强烈光照可以使PMA与DNA共价交联,同时完全钝化游离的PMA以避免"假阴性"结果;抑制死菌DNA扩增的最低PMA质量浓度为10μg/mL,不抑制活菌DNA扩增的最高PMA质量浓度为20μg/mL。当活菌/总菌大于1%时,经PMA预处理,可以消除热灭活菌DNA的干扰,实现对活菌的定量检测。; 李聪聪余以刚邱杨李美玲肖性龙吴晖; 关键词：定量PCR 活菌

食源性致病菌活菌检测技术研究进展被引量：7: 2011年; 食品中的病原菌引起食源性疾病,影响食品安全。能够有效区分死菌和活菌的检测方法在实际运用中具有指导意义,食源性致病菌检测技术向着快速、简便、特异的方向发展。本文依据检测原理介绍了活菌检测技术的研究进展。; 邱杨田聪余以刚肖性龙李聪聪刘建丽赵丽梅艳群; 关键词：致病菌活菌

PMA-qPCR方法用于监测超声波灭菌效率的适用性及其应用被引量：10: 2012年; 为研究PMA-qPCR方法的适用性问题,本文以超声波制备膜损伤细菌,用PMA-qPCR方法进行检测,并与平板计数的结果进行比较,证明该方法适用于监测超声波法灭菌率的监测。将该方法用于检测不同因素对超声波灭菌效率的影响,表明在温度和超声频率一定的条件下,处理时间和功率对灭菌效率的影响比较明显,而占空比对其影响较小。; 李聪聪余以刚邱杨肖性龙郭毅岱; 关键词：超声波

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广东省科技计划工业攻关项目(2011B020314004)

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