国家重点基础研究发展计划(2012CB720802)
- 作品数：28 被引量：159H指数：9
- 相关作者：陈坚堵国成陆健孙军勇周景文更多>>
- 相关机构：江南大学宿迁市江南大学产业技术研究院江苏洋河酒厂股份有限公司更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金高等学校学科创新引智计划更多>>
- 相关领域：轻工技术与工程生物学化学工程理学更多>>
- 重组酸性脲酶对黄酒中尿素和氨基甲酸乙酯的降解应用被引量：15
- 2016年
- 氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)作为一种潜在致癌物质普遍存在于传统发酵食品中。利用酸性脲酶消除EC前体物质尿素是一种具有潜在重要应用价值的策略。本研究在前期成功实现食品级耐乙醇酸性脲酶高效表达制备的基础上,系统研究了重组酸性脲酶对尿素和EC的水解过程。重组酸性脲酶对模拟体系以及黄酒体系中的尿素具有很好的降解能力(60mg/L的尿素在25h内完全被降解),表明该重组酸性脲酶适用于黄酒中尿素的消除。虽然重组酸性脲酶也具有降解EC的催化活性,但在黄酒中添加重组酸性脲酶对EC的浓度无明显影响。进一步研究发现重组酸性脲酶对尿素和EC的Km值分别为0.714 7mmol/L和41.32mmol/L,研究结果为应用定向进化策略改造重组酸性脲酶实现同时水解尿素和EC提供了理论依据。
- 周建立康振刘庆涛堵国成陈坚
- 关键词：氨基甲酸乙酯尿素食品安全酶法降解
- 酿酒酵母转运蛋白Agp1p泛素化对氮源利用的影响
- 2015年
- 【目的】研究酿酒酵母细胞膜关键氮源转运蛋白Agp1p的泛素化对其氮源利用的影响。【方法】构建一个基于双分子荧光互补技术的泛素化检测载体,检测Agp1p是否受到泛素化。采取定点突变的方法对Agp1p中可能的泛素化位点进行突变,研究其泛素化的关键作用位点及其对酿酒酵母氮源利用的影响。【结果】在谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸及铵盐为唯一氮源的培养基中,转运蛋白Agp1p均受到泛素化调控。定点突变实验结果显示,与出发菌株相比,潜在泛素化位点突变后,菌体荧光强度均有一定程度减弱。其中四重突变体Agp1pK11,14,98,112R荧光强度最弱,表明泛素化过程被显著抑制。系列突变菌株在9种氨基酸为复合氮源以及尿素为单一氮源的发酵实验表明,四重突变体菌体氮源利用率提高效果显著。【结论】转运蛋白Agp1p的泛素化受到不同氮源的影响,泛素化位点突变可以显著影响其泛素化过程,从而改变细胞对氮源的利用过程。
- 李应宇吕永坤周景文堵国成陈坚
- 关键词：酿酒酵母泛素化
- 鲁氏接合酵母对酱油中氨基甲酸乙酯前体物的代谢被引量：8
- 2016年
- 【目的】研究鲁氏接合酵母氮源代谢特性,确定鲁氏接合酵母氮源代谢与酱油中氨基甲酸乙酯前体物瓜氨酸和尿素积累的关系。【方法】通过单一氮源培养、偏好型氮源培养和盐胁迫培养,检测不同条件下鲁氏接合酵母对精氨酸、瓜氨酸和尿素的代谢能力。【结果】通过对鲁氏接合酵母氨基酸利用能力的分析,确定了甘氨酸、丙氨酸和天冬酰胺3种氨基酸为鲁氏接合酵母的偏好型氮源。在偏好型氮源存在时,鲁氏接合酵母对尿素和瓜氨酸的利用并不受到抑制,丙氨酸和甘氨酸还能够促进对二者的利用。鲁氏接合酵母在单一氮源培养条件下不会降解精氨酸而积累尿素和瓜氨酸,反而可以大量利用氨基甲酸乙酯的前体物尿素和瓜氨酸。但在盐胁迫下,鲁氏接合酵母利用尿素和瓜氨酸受到阻遏,从而造成酱油中氨基甲酸乙酯前体物不能被充分利用而积累。【结论】盐胁迫阻遏了鲁氏接合酵母对瓜氨酸和尿素的利用,从而造成酱油发酵过程中耐盐细菌所产生的氨基甲酸乙酯前体物的积累。
- 张继冉方芳陈坚堵国成
- 关键词：瓜氨酸氨基甲酸乙酯
- 乳酸足球菌精氨酸代谢与瓜氨酸积累被引量：3
- 2016年
- 酿造酱油中氨基甲酸乙酯的主要前体物质瓜氨酸由乳酸足球菌通过精氨酸代谢产生。为了研究酱油中瓜氨酸的积累机制,以分离自酱油成曲的乳酸足球菌Pediococcus acidilactici BBE1120为研究对象,考察不同培养条件(碳源、盐浓度、氨基酸)对其积累瓜氨酸的影响。结果表明,高盐环境是导致乳酸足球菌积累瓜氨酸的关键因素,碳源的种类及浓度对瓜氨酸的积累也有一定影响,培养基中精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸含量对瓜氨酸的积累影响不大。该研究结果对阐明酱油发酵过程中氨基甲酸乙酯前体物质的积累机制具有重要意义。
- 杨怡敏方芳周朝晖陈坚堵国成
- 关键词：酱油氨基甲酸乙酯瓜氨酸
- 反相高效液相色谱法测定黄酒中的草酸被引量：2
- 2012年
- 该文建立了一种利用反相高效液相色谱法测定黄酒中草酸的方法，该方法以邻苯二胺为衍生剂，在高温酸性条件下与草酸反应，生成强紫外吸收化合物——2，3-二羟基喹喔啉，对其检测的最优色谱条件是：DionexAcclaim120C18柱（4．6×250mm，5μm）；以甲醇和0．1mol／L乙酸铵（15：85v／v）为流动相；流速1．2mL／min；检测波长314nm；柱温25℃。该方法测定黄酒样品中草酸的回收率为91．40%--103．70％，相对标准偏差小于9．30％。该方法简便、准确，适合测定黄酒中草酸的含量。
- 谭新勇孙军勇谢广发陆健
- 关键词：反相高效液相色谱黄酒草酸
- 高通量筛选诱变菌株降低黄酒发酵氨基甲酸乙酯前体积累被引量：5
- 2017年
- 【目的】氨基甲酸乙酯是发酵食品中普遍存在的一种潜在危害物。黄酒中氨基甲酸乙酯的前体主要是尿素和乙醇。本研究通过高通量筛选策略降低黄酒发酵过程中尿素的积累,从而降低氨基甲酸乙酯积累。【方法】以一株黄酒生产工业菌株酿酒酵母XZ-11为研究对象,采用ARTP诱变和高通量筛选策略,获得尿素积累量较低菌株。使用实时定量PCR技术检测氮代谢中尿素代谢和转运相关基因(DUR1,2和DUR3)的变化。【结果】筛选得到一株尿素高效稳定性利用菌株5-11C。其尿素积累量比酿酒酵母XZ-11降低了50.6%。实时定量荧光PCR结果表明,与尿素代谢和转运相关的基因(DUR1,2和DUR3)表达量分别提高了3.3和2.2倍。【结论】高通量筛选策略可以用于降低黄酒生产过程中氨基甲酸乙酯前体尿素的含量。由于未采用基因工程手段,避免了可能的法规问题,消费者易于接受,在发酵食品行业具有较好的应用前景。
- 程艳堵国成周景文陈坚
- 关键词：高通量筛选实时定量PCR
- YDL080C和LEU2基因敲除对工业黄酒酵母异戊醇生成量的影响被引量：9
- 2015年
- 通过敲除生成途径中关键酶的编码基因,对异戊醇在工业黄酒酵母N85中的生成进行了研究。采用融合PCR技术,分别构建类丙酮酸脱羧酶基因(YDL080C)缺失组件"YDL080C-URA3-YDL080C"和β-异丙基苹果酸脱氢酶基因(LEU2)缺失组件"LEU2-URA3-LEU2",转化工业黄酒酵母N85尿嘧啶缺陷型单倍体Na-u(MATa ura3),获得单倍体工程菌Na-y和Na-l。将转化子与亲本分别进行实验室规模的黄酒发酵实验,结果 YDL080C缺失工程菌的异戊醇含量与亲本相比没有明显变化,说明类丙酮酸脱羧酶不是该途径关键酶;LEU2缺失工程菌的异戊醇含量降低16.16%,说明糖代谢途径存在,但只占小部分,而其他理化指标无明显差异。
- 李童孙军勇吴殿辉李晓敏谢广发陆健
- 关键词：异戊醇基因敲除
- 赖氨酸芽孢杆菌产氨基甲酸乙酯水解酶的发酵条件优化被引量：8
- 2017年
- 氨基甲酸乙酯是发酵酒精饮料及发酵食品中一种广泛存在的致癌物,酶法降解是解决氨基甲酸乙酯污染的重要途径之一。作者以一株来源于小鼠胃部具有水解氨基甲酸乙酯活性的菌株Lysinibacillus fusiformis SC02为出发菌株,通过摇瓶水平单因素实验对其产酶条件进行了优化。优化后的培养基组成为:半乳糖25 g/L,大豆蛋白胨20 g/L,尿素4 g/L,硫酸铜0.02 g/L,pH6.0。最佳产酶的发酵条件为:发酵温度37℃,接种体积分数3%,装液量20 m L/250 m L。在上述优化的培养基和培养条件下,产酶水平由900 U/L提高到4 500 U/L,提高了350%。在3 L发酵罐水平上初步探究了不同搅拌转速对菌株产酶的影响。当搅拌转速达到800 r/min,菌株最高酶活水平由4 500 U/L提高到7 066 U/L,提高了57%。
- 王伟高陈坚周景文
- 关键词：发酵条件优化芽孢杆菌发酵食品
- 变幻青霉氨基甲酸乙酯降解酶产酶条件优化及酶的底物特异性被引量：6
- 2013年
- 在单因素优化基础上,运用正交试验设计理论,优化氨基甲酸乙酯降解酶产生菌P.variabile JN-A525的产酶条件。优化发酵培养基配方为:葡萄糖20 g/L,牛肉膏10 g/L,KH2PO45g/L、NaCl 1 g/L、KCl 5 g/L;发酵条件为:初始pH 6.0、培养温度32℃、接种体积分数3%、250 mL摇瓶装量70 mL、摇床转速100 r/min,在此优化条件下酶活比优化前提高了3.47倍。对经超声破碎、(Na)2SO4盐析、Superdex G-75凝胶过滤层析步骤初步纯化的酶之底物特异性的研究表明,在模拟黄酒体系下,该酶对尿素和氨基甲酸乙酯有相对强的降解作用,对一些酯类和氨基酸没有降解作用。
- 谷晓蕾田亚平
- 关键词：底物特异性
- 黄酒酵母ADH2、ALD2和ALD6基因敲除对黄酒中乙醛代谢的影响被引量：2
- 2016年
- 以工业黄酒酵母N85尿嘧啶缺陷型单倍体2a-u3(MATa ura3)为出发菌株,研究分别敲除乙醛代谢相关酶的编码基因ADH2、ALD2和ALD6对乙醛代谢的影响。采用融合PCR技术分别构建乙醇脱氢酶编码基因ADH2敲除组件"ADH2S-URA3-ADH2X"和乙醛脱氢酶编码基因ALD2和ALD6敲除组件"ALD2S-URA3-ALD2X"和"ALD6S-URA3-ALD6X",转化N85尿嘧啶缺陷型单倍体菌株后,以尿嘧啶缺陷型的恢复为筛选标记,分别获得ADH2、ALD2和ALD6基因缺失菌株2a-A2(Δadh2)、2a-D2(Δald2)和2a-D6(Δald6)。分别将获得的工程菌与亲本菌株以及前期构建的丙酮酸脱羧酶基因PDC5缺失菌株2a-P5(Δpdc5)进行实验室规模的黄酒发酵实验。结果表明,与亲本菌株2a相比,工程菌2a-A2发酵液中乙醛含量降低了7.14%,而2a-P5发酵液中乙醛含量降低了32.68%,说明工业黄酒酵母乙醛的生成存在糖代谢途径,并且乙醛主要由丙酮酸脱羧而来;工程菌2a-D2和2a-D6发酵液中乙醛含量与亲本相比分别增加了144.91%和88.87%,说明乙醛脱氢酶是黄酒中控制乙醛降解的关键酶,而且ALD2基因在乙醛转化为乙酸过程中发挥更关键的作用。
- 刘华孙军勇谢广发陆健吴殿辉李童吴宗文
- 关键词：黄酒酵母基因敲除乙醛
