国家高技术研究发展计划(2006AA02Z153)
- 作品数：14 被引量：58H指数：5
- 相关作者：金坚张莲芬李华钟李洁周利苹更多>>
- 相关机构：江南大学中国科学院淮海工学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划江苏省卫生厅科研基金教育部“新世纪优秀人才支持计划”更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学轻工技术与工程更多>>
- 人β干扰素与人血清白蛋白融合蛋白的表达及纯化被引量：6
- 2009年
- 为开展人β干扰素-人血清白蛋白融合蛋白(IFNβ-HAS)的临床前研究,本研究采用免疫学方法对毕赤酵母转化子进行筛选,得到高产菌株8株。在5L发酵罐上对高产菌株进行诱导表达,产量达500mg/L。发酵液经超滤浓缩、染料亲和层析、镍离子螯合亲和层析和DEAE离子交换层析纯化后,融合蛋白纯度达到96%。Westernblotting杂交表明融合蛋白具有人血清白蛋白和人β干扰素的抗原性,细胞病变抑制法测定IFNβ-HSA比活性为1.96×107IU/mg。建立了融合蛋白的生产工艺,为IFNβ-HSA的临床前研究奠定了基础。
- 张琦雷楗勇丁月娣陈蕴屈琳陈淑娴金坚
- 关键词：Β干扰素融合蛋白毕赤酵母
- 人脑钠肽融合蛋白(HSA-(BNP)_2)在毕赤酵母中的发酵条件及纯化研究被引量：1
- 2009年
- 对毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-HSA-(BNP)2的发酵条件进行了优化,并对表达产物HSA-(BNP)2融合蛋白的纯化工艺进行了摸索。研究表明,菌体生长28h时菌浓较高,可进行诱导;同时,在2%甲醇浓度、培养液浓缩1.5倍、诱导表达72h时融合蛋白产量可达185mg/L。发酵液超滤浓缩后经Q Sepharose强阴离子交换层析和Superdex75凝胶过滤层析,获得的融合蛋白纯度为93%,Western blot分析其既具有BNP免疫原性又具有HSA免疫原性。毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-HSA-(BNP)2经发酵优化后能高效表达HSA-(BNP)2融合蛋白,经两步层析获得的融合蛋白满足后期药效学与药代动力学实验的要求,为后续研究奠定了基础。
- 丁月娣刘天会陈蕴张莲芬金坚
- 关键词：脑钠肽融合蛋白毕赤酵母发酵优化纯化
- 一株产低温碱性蛋白酶海洋细菌Pseudoalteromonas flavipulchra HH407的筛选与生长特性被引量：15
- 2007年
- 对从连云港海域筛选的一株产低温碱性蛋白酶的海洋适冷菌HH407进行的鉴定和生长特性研究结果表明,该菌为革兰氏阴性杆菌,好氧,端生鞭毛,无芽孢及荚膜,大小为0.4～0.7μm×1.0～1.8μm,在酪蛋白培养基的菌落特征为椭圆金黄色、光滑、半透明、四周隆起。根据其生理生化性质、16S rDNA同源性和系统进化树分析初步鉴定该菌属于Pseudoalteromonas flavipul- chra。该菌的生长温度范围为0～40℃,最适生长温度为20℃;pH范围为5.5～11.0,最适生长pH值为8.5;NaCl质量浓度范围为0.5～13 g/dL,最适生长NaCl质量浓度为4 g/dL,无NaCl时不能生长。该菌能较好利用胰蛋白胨、酵母膏和蛋白胨等蛋白质物质,对糖的利用较差。该菌株所产蛋白酶在pH 10.0和35℃时表现最高酶活。
- 李丹陈丽李富超王淑军李华钟
- 关键词：PSEUDOALTEROMONAS低温碱性蛋白酶海洋细菌
- 重组毕氏酵母中降解hIFN-βHSA蛋白酶的鉴定及其活性控制被引量：1
- 2008年
- 研究了重组毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA表达融合蛋白hIFNβ-HSA过程中产物降解的问题。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-Blotting分析结果表明,发酵液中除了9.0×104的目的融合蛋白hIFNβ-HSA外,同时还出现了6.5×104的降解带,进一步结合HPLC分析证实该降解发生在融合蛋白hIFNβ-HSA的HSA区域。在此基础上,采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)活性电泳的方法,确定在融合蛋白hIFNβ-HSA表达的过程中,引起融合蛋白hIFNβ-HSA降解的蛋白酶为蛋白酶B(Proteinase B,PrB)。最后,确定了可以抑制融合蛋白hIFNβ-HSA降解的最佳的蛋白酶抑制剂EDTA,通过在诱导表达阶段添加不同浓度的蛋白酶抑制剂EDTA,使融合蛋白的表达量达到22.18 mg/mL,与空白对照组相比增加了61%。
- 宋一丹窦文芳许泓瑜金坚陆茂林许正宏
- 关键词：蛋白酶
- 产HSA-CP融合蛋白毕赤酵母的发酵条件优化被引量：4
- 2009年
- 为提高重组毕赤酵母生产人血清白蛋白-C肽融合蛋白(HSA-CP)的产量和生产强度,在摇瓶条件下考察了甲醇诱导时间和浓度对目的蛋白产量的影响。结果表明,质量浓度10 g/L的甲醇诱导72 h最适于产物表达。通过对7L发酵罐中各因素的优化,得到最佳条件为:初始甘油质量浓度10 g/L,30℃培养,菌体生长期和诱导期的pH及溶氧分别控制在pH5.0、30%溶解O2或pH6.0、15%的溶解O2。10 g/L的甲醇诱导72 h,最终使干细胞质量浓度达到56.43 g/L,目的蛋白产量达368.45 mg/L。生产强度为3.920 mg/(L.h),目标蛋白的比生产速率为5.12 mg/(L.h)。
- 孔静静王长城杨海麟张玲周利苹金坚王武
- 关键词：巴斯德毕赤酵母发酵优化
- 人脑钠肽与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及其活性被引量：5
- 2009年
- 目的在毕赤酵母中表达重组人脑钠肽(BNP)与人血清白蛋白(HSA)融合蛋白,并检测其活性。方法重叠PCR法拼接BNP二联体与HSA基因,插入表达载体pPIC9K,电穿孔法转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析、Western blot鉴定及活性检测。结果融合基因(BNP)2-HSA经测序正确,重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确。诱导72h,融合蛋白表达量最高,可达200mg/ml,且具有良好的反应原性,其活性为rhBNP标准品的1%。结论已在毕赤酵母中成功表达了具有一定生物活性的(BNP)2-HSA融合蛋白,为开发BNP长效药物奠定了基础。
- 丁月娣雷楗勇陈蕴张莲芬金坚
- 关键词：人血清白蛋白融合蛋白毕赤酵母生物活性
- 人血清白蛋白-C肽融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达被引量：3
- 2008年
- 目的构建重组表达人血清白蛋白(HSA)-C肽(CP)融合蛋白的毕赤酵母表达菌株。方法根据表达系统的密码子偏好性优化CP基因,酶切连接pBlue-HSA质粒(HSA1 800bp)和CP(100bp)基因,将HSA-CP融合基因双酶切后插入分泌表达载体pPIC9K中,重组质粒pPIC9K-HSA-CP经SalⅠ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,表型筛选Mut+转化子。PCR鉴定后,用甲醇诱导摇瓶分泌表达。结果融合基因约为1 900bp,序列测定正确。SDS-PAGE分析表明表达融合蛋白的相对分子量约为70kD,摇瓶培养表达量为140mg/L,Western blot鉴定显示表达的融合蛋白为HSA和CP的杂合分子。结论实现了HSA-CP融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达,细胞活性研究显示HSA-CP融合蛋白对人胚肾293细胞的生长具有一定的促进作用。
- 周利苹张莲芬雷楗勇张文婷蔡燕飞金坚
- 关键词：C肽人血清白蛋白融合蛋白毕赤酵母
- 人GCSF-白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达被引量：6
- 2008年
- 制备人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。从新鲜人外周血中分离单核细胞,给予大肠杆菌脂多糖刺激后,RT-PCR制备G-CSF cDNA,以其为模板扩增得到人G-CSF的编码区序列(525 bp)。重叠PCR拼接HSA-GCSF融合基因(2277 bp),序列测定正确,中间未加入任何连接肽。插入表达载体pPIC9K中α交配因子的开放阅读框内,构建分泌型表达重组质粒pPIC9K-HSA-GCSF。电击转化毕赤酵母菌KM71,G418筛选得到高拷贝转化子。甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的相对分子质量约为84 k,Western blot分析融合蛋白为G-CSF与HSA的杂合分子,NFS-60细胞/MTT比色法测定融合蛋白具有G-CSF的生物学活性。结果:构建了可分泌表达HSA-GCSF融合蛋白的毕赤酵母工程菌,为进一步对其进行药学研究奠定了基础。
- 徐钰孙钧铭张莲芬窦文芳李洁朱威朱书峰金坚
- 关键词：人粒细胞集落刺激因子人血清白蛋白融合蛋白毕赤酵母
- 王不留行提取物对内皮细胞增殖、迁移及其黏附的作用评价被引量：12
- 2009年
- 目的体外分析王不留行抑制人微血管内皮细胞(HMEC)增殖、迁移和黏附的有效部位。方法SRB法测定药物干预细胞增殖的IC50和药物作用时间与药效学的关系;划线灼伤法研究细胞迁移;体外基质胶分析药物对细胞黏附能力的影响;HE染色观察药物对细胞染色体的影响。结果王不留行有效部位对HMEC增殖抑制的IC50为3.60mg.L-1,加药4h后起作用。加药48h后HMEC迁移受到明显抑制(迁移率为40.33%,对照组迁移率为77.68%)。加药组细胞黏附受到明显抑制,且呈浓度依赖关系。结论王不留行提取物能明显抑制内皮细胞增殖、迁移及黏附,因此具有潜在的价值用于抑制血管生成。
- 夏明星张莲芬王一君李英金坚
- 关键词：细胞增殖细胞迁移细胞黏附
- 王不留行中抗人微血管内皮细胞增殖的有效组分的分离和纯化被引量：4
- 2009年
- 从中药王不留行中筛选具有抑制内皮细胞增殖的有效单一组分。大孔树脂吸附法进行总皂甙的分离纯化,分别收集不同浓度乙醇溶液洗脱液用SRB法进行细胞活性检测,选择有效部分用AKTA Resource柱分离,按紫外吸收峰收集洗脱液并进行活性验证,通过蒸发光散射检测组分复杂程度,选择活性高、丰度大、成份简单的峰进行C18柱分离。结果表明,王不留行提取液经大孔树脂分离和细胞活性检测发现50%～90%乙醇浓度洗脱液具有细胞活性,经AKTA Resource柱分离得7种组份群(0～6),细胞活性测得3～6号组分有活性,选择4号组分过C18柱得5组分(A～E),B组分为有紫外吸收的主峰,但无细胞活性,其活性分布于D和E组分中,其IC50值为3.75μg/ml,D组分经蒸发光散射检测为单峰。经上述方法分离纯化获得抑制人微血管内皮细胞增殖的单一组分群,其单一化合物具有潜在的利用价值。
- 夏明星冯磊张莲芬李英储敏金坚
- 关键词：王不留行内皮细胞分离纯化
