福建省教育厅科技项目(JA11152)
- 作品数：4 被引量：6H指数：2
- 相关作者：李利君倪辉蔡慧农李天丽苏文金更多>>
- 相关机构：集美大学更多>>
- 发文基金：福建省教育厅科技项目福建省自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程更多>>
- 实时定量PCR构建法夫酵母内参基因β-actin、gpd、18S rRNA标准品质粒和标准曲线被引量：2
- 2013年
- 为建立检测法夫酵母JMU-MVP14中虾青素合成相关基因在不同生长时期表达水平的实时定量PCR方法,构建法夫酵母JMU-MVP14的管家基因β-actin、gpd、18S rRNA的标准质粒,进行实时定量PCR,制作标准曲线及回归方程。β-actin基因标准曲线相关系数(R2)=0.9956,扩增效率(E)=96.93%;gpd基因标准曲线相关系数(R2)=0.9901,扩增效率(E)=93.78%;18S rRNA基因标准曲线相关系数(R2)=0.9981,扩增效率(E)=98.76%。3个基因片段的熔解曲线均呈单峰;扩增曲线呈典型的S型动力学曲线,指数期和平台期明显,为理想的熔解曲线和扩增曲线。用geNorm软件对三个管家基因的稳定性进行分析,三个基因的稳定性排序为β-actin>18S rRNA>gpd,故β-actin和18S rRNA较适合作为研究法夫酵母JMU-MVP14定量实验的内参基因。
- 李天丽郑晨华李利君倪辉蔡慧农
- 关键词：实时定量PCR法夫酵母
- 法夫酵母整合型表达载体的构建
- 2014年
- 为了建立法夫酵母虾青素代谢途径研究和分子育种的技术体系,构建了法夫酵母的整合型表达载体.通过测定法夫酵母对G418的抗性来确定抗性筛选物的质量浓度,以来源于法夫酵母本身的rRNA基因为基因同源重组片段,利用法夫酵母肌动蛋白启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)启动子,构建了携带G418抗性基因的整合型载体pMD-18spakta和pMD-18spgktg.结果表明:法夫酵母对20μg/mL质量浓度的G418敏感,将构建的载体转化法夫酵母菌株后,筛选得到了能够在含有G418的培养基上生长的转化子;利用PCR的方法检测到转化子中存在的抗性基因.将筛选得到的阳性菌株连续传代培养10次后,发现该菌株的G418抗性仍然存在;以总DNA为模板,用PCR的方法仍可检测到G418抗性基因.说明已经构建得到了遗传稳定性良好的法夫酵母整合型表达载体,构建的质粒pMD-18spakta和pMD-18spgktg可作为法夫酵母整合载体应用于法夫酵母的DNA重组实验.
- 陈丽娜朱艳冰倪辉李利君
- 关键词：法夫酵母
- 法夫酵母虾青素合成途径相关基因的研究进展被引量：3
- 2013年
- 法夫酵母能合成一种具有很高商业价值的类胡萝卜素——虾青素。它广泛应用于饲料、保健品、医药、化妆品等行业。探索法夫酵母中虾青素合成途径及其调控机理对天然虾青素资源的开发具有重要的意义。虽然许多学者通过各种方法对该途径进行了一系列的研究,但其机理目前尚未完全阐明。本文综述了法夫酵母虾青素合成途径以及合成途径中相关基因的研究进展,并对基于基因调控的产量提高策略进行了讨论,为利用基因工程技术进行定向育种提供了思路。
- 李天丽蔡慧农李利君倪辉苏文金
- 关键词：法夫酵母虾青素
- 法夫酵母β-胡萝卜素转化酶(Asy)基因的克隆及可溶性表达研究被引量：1
- 2013年
- 【目的】从高产虾青素的法夫酵母(Phaffia rhodozyma)7B12菌株中克隆β-胡萝卜素转化酶基因(β-Carotene converting enzyme gene,asy),并将该基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行可溶性表达,为深入研究该酶的性质及应用提供基础。【方法】采用cDNA末端快速扩增技术,克隆得到asy基因全长cDNA序列,将其克隆到表达载体pET32a中,通过优化温度和IPTG浓度提高其可溶表达量;进一步在E.coli BL21(DE3)中共表达携带asy基因的重组质粒和pACCAR16Δcrtx质粒(携带由乙酰辅酶A合成β-胡萝卜素的基因链),用液相色谱分析共转化菌株中类胡萝卜素种类的变化,鉴定可溶性表达的Asy酶活性。【结果】法夫酵母7B12菌株asy基因的cDNA序列与GenBank能检索到的唯一一条asy基因mRNA序列(Accession No.DQ002007.1)一致性达到97%,该序列总长1 971 bp,最大开放阅读框为1 614 bp,编码538个氨基酸,在E.coli BL21(DE3)中表达的Asy融合蛋白分子量约为70 kD;条件优化后转化asy基因的重组菌在26°C、0.5 mmol/L IPTG的条件下诱导时,可溶性融合蛋白比例达85%。与pACCAR16Δcrtx单质粒转化相比,共转化pACCAR16Δcrtx及asy基因的菌株类胡萝卜素产物的成分发生了明显的变化,其中α-胡萝卜素的含量明显减少,伴随出现了3种新的色素,根据出峰时间判断其中一种为β-胡萝卜素和虾青素的中间产物——β-隐黄质。【结论】从法夫酵母中克隆得到asy基因,通过优化诱导温度及IPTG浓度等条件提高了该基因在E.coli BL21(DE3)中的可溶性表达量,经鉴定可溶性的Asy融合蛋白具有转化β-胡萝卜素的活性。
- 曹樱蔡慧农李利君倪辉苏文金
- 关键词：法夫酵母可溶性表达活性分析
