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利用细菌人工染色体同源重组对小鼠基因进行条件型敲除: 2010年; 目的:探索通过细菌人工染色体(BAC)同源重组系统构建条件基因敲除载体的高效率方法,提高条件基因敲除小鼠(Flox小鼠)的构建效率。方法:利用作者自己构建的噬菌体重组酶系统,通过BAC同源重组进行条件型基因敲除载体构建工作。首先通过亚克隆构建了一系列载体含有同源臂的靶向质粒,线性化后,打靶片段经电穿孔法转入大肠杆菌内,与相应的BAC同源重组,再经过三步同源重组和一步位点特异性重组,构建小鼠条件型基因敲除载体。结果:高效率构建了小鼠基因的最终条件基因敲除载体。结论:通过BAC同源重组高效构建条件基因敲除载体,为条件基因敲除载体的构建提供了全新思路,并为FLox小鼠的建立,及相应基因在发育、生理、致病机制等方面的功能研究奠定了基础。; 王立良王淼王浩张玉建刘勇邵一鸣; 关键词：细菌人工染色体同源重组打靶载体

缺失IFN-γ受体基因的天坛株减毒重组痘苗病毒载体的构建被引量：4: 2004年; 目的　构建缺失IFN γ受体基因的天坛株重组痘苗病毒载体 ,初步研究其毒力的改变及B8R缺失区插入外源基因表达的稳定性。为研制表达多价抗原重组痘苗病毒载体、提高痘苗病毒载体安全性进行探索。方法　采用PCR技术、多步克隆构建带有天坛株痘苗病毒B8R基因外左右侧同源臂、痘苗病毒启动子序列pE L、p7 5及下游LacZ序列的转移质粒pSKB8R、pSKB8RLacZ。将痘苗病毒VTT与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组 ,经蓝白斑筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因 (IFN γ受体基因同源序列 )缺失为LacZ所取代的重组病毒VTT△B8RLacZ。结果　经酶切、测序鉴定转移质粒构建正确 ,核酸水平、外源基因生物学活性检测表明VTT△B8RLacZ在CEF细胞连续培养传代中B8R基因的缺失和插入外源基因LacZ表达均很稳定。VTT△B8RLacZ在细胞中的繁殖复制水平与VTT相当。兔皮内毒力实验表明B8R基因缺失显著降低VTT的毒力。结论　本研究表明B8R基因缺失可显著降低痘苗病毒天坛株的毒力并可作为外源基因的插入区 ,缺失B8R基因的重组痘苗病毒可能作为新一代的表达多价抗原痘苗病毒载体。; 黄薇刘颖段丹丽李海山刘勇洪坤学朱家鸿邵一鸣; 关键词：基因缺失病毒载体

增强子驱动的Cre转基因小鼠的构建及Cre基因的表达鉴定被引量：1: 2010年; 目的:探索将增强子应用于构建Cre转基因小鼠品系,为以条件基因敲除为基础的基因功能研究提供更多的工具。方法:通过PCR方法从小鼠的细菌人工染色体扩增UH增强子片段,构建含有Hsp68基础启动子、增强子UH、Cre重组酶基因和SV40 polyA的转基因载体pLW400,将3.3 kb的转基因片段通过显微注射导入小鼠受精卵;为了检测Cre在转基因小鼠中的表达,将转基因一代小鼠与纯合子ROSA26报告小鼠(R/R)交配,收集第14 d胚胎期(E14)的舌组织进行LacZ染色检测鉴定。结果:经鉴定,31只子代小鼠中有6只携带外源基因,整合率为19.4%;与R/+对照相比,E14期的双基因型Cre,R/+舌组织为阳性结果(蓝色)。这表明Cre基因在转基因小鼠舌组织内得到表达,并在体内介导ROSA26基因座loxP位点间的重组,且有效删除了2个loxP之间的片段,从而启动了LacZ基因的表达。结论:构建了UH增强子-Hsp68Cre的转基因小鼠,在舌肌中特异表达Cre基因,提示增强子可以被选择应用于Cre转基因小鼠的构建;为舌肌的发育和再生研究奠定了基础。; 王立良王淼张玉建王浩刘勇邵一鸣; 关键词：增强子 CRE重组酶转基因小鼠

DNA疫苗及其优化策略被引量：10: 2003年; DNA疫苗既可以诱导细胞免疫又可以诱导体液免疫反应 ,是最有希望成功的新一代疫苗之一。但免疫原性相对较弱 ,限制了 DNA疫苗的广泛应用 ,需要进一步优化。本文对 DNA疫苗的历史 ,优缺点 ,免疫机制 ,尤其是优化策略进行了综述 ,并对 DNA疫苗的应用前景进行了展望。; 李海山刘勇邵一鸣; 关键词：DNA疫苗 DNA免疫免疫机制安全性耐受力

经基因优化的HPV16L1蛋白在毕赤酵母中的表达被引量：4: 2007年; 目的利用毕赤酵母表达系统(Pichia pastoris)高效表达HPV16L1蛋白。方法按照Pichia pastoris密码子偏爱性合成HPV16L1基因,构建pAO819r-16L1表达载体,电转化至GS115菌株中,经MD板和不同浓度G418筛选,挑取高拷贝整合菌株,甲醇诱导目的蛋白的表达,用HPV16L1抗血清,经Western blot检测蛋白的特异性。结果重组质粒pAO819r-16L1在甲醇营养型酵母菌株中经甲醇诱导后可表达HPV16L1蛋白,在试管中的表达量超过10mg/ml,经Western blot验证,该蛋白可与抗血清特异结合,在相对分子质量55000附近出现目的条带,证明该蛋白确为HPV16L1蛋白。结论利用毕赤酵母表达系统可高效表达HPV16L1蛋白,为研制HPV疫苗奠定基础。; 董金蓉谢飞刘勇郭仁彭建新刘红岩; 关键词：人乳头瘤病毒 L1蛋白毕赤酵母

重组破伤风毒素C片段的原核表达、纯化及其活性: 2010年; 目的原核表达、纯化重组破伤风毒素C片段(rTTC),并进行活性鉴定。方法采用PCR法从破伤风梭菌基因组DNA中扩增TTC基因片段,将其插入载体pThioHisA中,构建重组表达质粒rTTC-pThioHisA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。表达的rTTC蛋白经离子交换、凝胶层析两步纯化后,采用Western blot、免疫双扩散及动物免疫试验进行活性及免疫原性鉴定。结果重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白以包涵体和可溶性形式存在;纯化的重组蛋白纯度大于95%,能与全段破伤风毒素(TT)抗体反应,rTTC抗体能与全段TT反应。rTTC能较好地诱导家兔产生免疫反应,但诱导小鼠产生的免疫反应较弱。结论已原核表达并纯化了rTTC,其有望开发为一种新型抗破伤风芽孢梭菌疫苗及细菌多糖类结合疫苗的蛋白载体。; 付作申花艳红金贞姬伊纯德苏彩霞陈尔佳刘勇邵一鸣; 关键词：原核表达纯化活性

DNA疫苗的安全性研究被引量：3: 2004年; DNA疫苗作为第三代疫苗与传统疫苗相比具有很多优越性,对其安全性的评价主要包括DNA疫苗与宿主细胞基因整合的可能性,接种后诱导宿主免疫耐受和自身免疫病的可能性,以及临床试验中受试者的耐受性等方面。本文就DNA疫苗安全性研究进展和相应法规的制定情况作一综述。; 王道毅刘勇陈静娴; 关键词：DNA疫苗安全性接种免疫耐受自身免疫病

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刘勇