刘志佳
- 作品数：3 被引量：4H指数：1
- 供职机构：第四军医大学更多>>
- 发文基金：军队医药卫生科研基金“重大新药创制”科技重大专项国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 一种检测A型肉毒毒素的高灵敏度酶联免疫吸附法被引量：3
- 2012年
- 目的:建立检测A型肉毒毒素的酶联免疫吸附法。方法:利用重组A型肉毒毒素重链羧基端片段作为免疫原和B淋巴细胞杂交瘤技术,获得了56株高亲和力的抗A型肉毒毒素单克隆抗体(mAb),建立了检测A型肉毒毒素的双mAb夹心酶联免疫吸附法(ELISA)。结果:该方法理论检测下限达到了8.34 pg/mL,检测天然A型肉毒毒素制剂时其实际检测下限可达0.78 LD50/mL,与其他型别的肉毒毒素均未见交叉反应。通过测定基质中的回收率,发现基质中的相关的蛋白对检测具有较大的影响。结论:该方法具有灵敏度高,特异性好,使用方便等优点,具有较高的的实用价值。
- 刘志佳李永明宋朝君李娜卢卫嘉孙元杰毛晓燕杨琨金伯泉
- 关键词：A型肉毒毒素酶联免疫吸附法单克隆抗体
- 截短型BAP31/GST基因重组质粒的构建及融合蛋白的表达、纯化和鉴定
- 2011年
- 目的构建编码截短型肿瘤抗原BAP31(△BAP31)与GST融合基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并对融合蛋白(△BAP31/GST)进行纯化和初步鉴定。方法 PCR扩增编码△BAP31的基因片段,上下游分别引入EcoR I及Xho I酶切位点,亚克隆至含有GST标签的原核表达载体pGEX4T-1中,构建重组表达载体pGEX4T1-△BAP31,将该载体转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达△BAP31/GST,用GST亲和层析分离纯化原核表达的△BAP31/GST,表达产物分别用SDS-PAGE和West-ern blot进行鉴定。结果重组质粒经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切鉴定和IPTG诱导表达△BAP31/GST的SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量为40 000,与理论值相符,并主要以可溶性蛋白形式存在;经过对融合蛋白表达条件的优化,在IPTG浓度为1 mmol/L,诱导6 h目的蛋白表达量最高;灰度扫描分析发现,融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的70.6%,纯化产物的纯度最高可达94.5%,Western blot证实该△BAP31/GST可与抗GST单克隆抗体(mAb)发生特异性结合反应,分子量为△BAP31与GST分子量之和,提示为融合蛋白。结论成功构建了编码△BAP31基因原核表达载体pGEX4T1-△BAP31,利用大肠杆菌表达系统和GST亲和层析,获得了较高纯度的△BAP31/GST融合蛋白,为进一步研究肿瘤抗原BAP31的功能及开发以BAP31作为靶点的肿瘤疫苗提供了试验基础。
- 李海涛宋朝君孙元杰魏玉英李永明刘飞刘志佳张葵金伯泉杨琨
- 关键词：GST融合蛋白蛋白表达
- 抗SEB单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的基因构建和表达被引量：1
- 2013年
- 目的从分泌抗SEB的单克隆抗体(FMU-SEB-No.1)杂交瘤细胞中,克隆出FMU-SEB-No.1重链和轻链可变区(VH和VL)基因,构建FMU-SEB-No.1单链抗体(scFv)的原核表达载体,并进行scFv基因的蛋白表达。方法从FMU-SEB-No.1杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR扩增出VH和VL基因;通过在引物上设计linker序列,拼接VH和VL为完整FMU-SEB-No.1的scFv基因(FMU-SEB-scFv)。将测序正确的scFv基因克隆入PGEX4T-1载体,转化入E.coli BL21(DE3)进行蛋白表达。通过SDS-PAGE,Western blot法分析其表达水平和特异性,酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定其抗原结合活性。结果测序结果显示,本实验成功克隆出FMU-SEB-No.1重链及轻链可变区基因,并成功构建FMU-SEB-scFv基因,所得的基因全长为750 bp,编码250个氨基酸。SDS-PAGE和Western blot分析表明,PGEX4T1-FMU-SEB-scFv在E.coli BL21(DE3)可表达为Mr约54 000的可溶型scFv/GST融合蛋白。间接ELISA检测结果表明,可溶型scFv/GST融合蛋白与SEB具有较高的抗原结合活性。结论制备并鉴定了针对SEB的基因工程抗体,为开发出针对SEB的治疗性抗体奠定了实验基础。
- 孙元杰李永明刘志佳张葵魏玉英宋朝君周幸春金伯泉杨琨
- 关键词：SEB单链抗体蛋白表达酶联免疫吸附法
