王莉
- 作品数：9 被引量：13H指数：2
- 供职机构：吉林农业大学动物科学技术学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金公益性行业(农业)科研专项更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学更多>>
- 水溶性量子点标记空肠弯曲菌黏附蛋白的制备被引量：1
- 2017年
- 为建立荧光免疫分析方法对空肠弯曲菌的快速检测,利用基因工程技术构建pET32a-peb1A原核表达载体,并对重组蛋白进行了抗原性分析。利用共价偶联的方法,在水溶性缩合剂EDC和催化剂DMAP的作用下,使水溶性量子点的羧基与重组蛋白的羟基结合,发生酯化反应,并通过磷酸盐缓冲溶液进行透析纯化得到目标偶联物。采用荧光分光光度法对偶联物进行表征,并利用荧光偏振免疫分析方法对空肠弯曲菌阳性血清进行检测。结果表明:空肠弯曲菌黏附蛋白PEB1A具有良好的抗原性,且量子点标记空肠弯曲菌黏附蛋白前后的荧光光谱发射峰由595 nm偏移至592 nm。示踪物与阳性血清混合前后荧光偏振值变化△80mP。由此证明,空肠弯曲菌黏附蛋白成功偶联到水溶性量子点上,且结构未受到破坏。通过荧光偏振法实现了对空肠弯曲菌的检测,所制备的示踪物具有良好的特异性,为建立荧光疫分析方法对空肠弯曲菌的快速检测提供依据。
- 王莉沙洲李诗语卢晓冉卜昭阳梁佳茗郎需龙王兴龙
- 关键词：空肠弯曲菌黏附蛋白原核表达量子点荧光免疫分析
- 表达Omp31基因重组牛布鲁菌的构建及鉴定被引量：2
- 2019年
- 为提高布鲁菌疫苗株的免疫保护效果,本试验以牛布鲁菌疫苗株S19为研究对象,将羊布鲁菌Omp31基因克隆、扩增并插入至广宿主质粒pBBR1MCS-2中,构建重组质粒pBBR1MCS-Omp31;通过电转化的方式转入S19感受态细胞中,经抗性基因筛选和PCR验证,获得重组牛布鲁菌S19-Omp31株;该重组菌株连续传25代未发现重组质粒和Omp31基因丢失,表明其遗传稳定性良好;进一步经SDS-PAGE检测可见约26 000相对分子质量的目的条带,采用Western blot法检测显示目的蛋白可与His单克隆抗体及Omp31蛋白高免血清反应。本研究构建的重组牛布鲁菌S19-Omp31株能够稳定表达目的基因,为进一步开展S19-Omp31株的免疫效果评价奠定基础。
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- 羊布鲁菌16MUGPase基因缺失株的构建及其特性分析被引量：2
- 2017年
- 目的构建羊布鲁菌16M株的尿苷三磷酸-葡萄糖-1-磷酸-尿苷酰基转移酶(UTP-glucose-1-phosphate-uridylyltransferase,简称UGPase)基因缺失候选疫苗株,并对其侵染宿主巨噬细胞的能力及毒力进行初步分析。方法采用PCR技术对羊布鲁菌的UGPase基因上、下游同源臂进行克隆,利用基因同源重组技术构建自杀质粒,经两步筛选法对重组菌株筛选后,进行巨噬细胞黏附侵袭试验和小鼠体内毒力试验。结果自杀质粒p BK-CMV-Sac B-△UGP构建成功,经双向筛选获得了羊布鲁菌UGPase基因缺失株16M△UGP。16M△UGP缺失株侵入巨噬细胞的CFU数低于16M强毒株,但高于M5疫苗株;小鼠攻毒14 d后,其平均脾指数为(6.55±0.27)g,平均克脾菌数为1.64×104CFU/g,均低于16M强毒株。结论成功构建了羊布鲁菌16M株的UGPase基因缺失株,并证实了UGPase基因的缺失对16M株毒力具有一定影响。
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- 关键词：毒力
- ST酿酒酵母基因工程菌对大鼠肠道菌群的影响被引量：1
- 2017年
- 为了研究ST酿酒酵母基因工程菌对大鼠肠道菌群的影响,试验将90只SPF级SD大鼠随机分为空白对照组、工程菌组及酵母菌组,分别灌服生理盐水、工程菌菌液、酿酒酵母菌菌液,持续21 d后连续3 d灌服大肠杆菌H10407菌液,分别收集灌胃7,14,21天及攻毒后的各组大鼠粪便,提取粪便细菌DNA,利用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)、实时荧光定量PCR检测了ST酿酒酵母基因工程菌对肠道菌群微生物可操作单元(OTU)和肠道5种重要细菌(类杆菌、梭菌、肠球菌、双歧杆菌和乳杆菌)数量的变化,并测定了肠道菌群pH值。结果表明:在灌胃期间,工程菌组及酵母菌组的OTU值和双歧杆菌、梭菌数量极显著高于空白对照组(P<0.01),其他细菌数量均不同程度升高。各组pH值均呈现下降趋势,第21天时,工程菌组及酵母菌组pH值极显著低于空白对照组(P<0.01)。攻毒产肠毒素大肠杆菌后,工程菌OTU值和类杆菌、乳杆菌、双歧杆菌数量均极显著高于其他两组(P<0.01),pH值极显著高于空白对照组(P<0.01)。与灌服前相比,工程菌组的OTU值、细菌数量及pH值均变化幅度最小。说明ST酿酒酵母基因工程菌能够改善肠道菌群结构,丰富肠道菌群多态性,降低pH值,增加有益菌群的数量。当动物机体受到产肠毒素大肠杆菌感染时,ST酿酒酵母基因工程菌能够有效降低产肠毒素大肠杆菌对肠道菌群的破坏,发挥预防保护作用,维持肠道内菌群稳定。
- 沙洲李诗语卢晓冉王莉卜昭阳王兴龙
- 关键词：实时荧光定量PCRPH值肠道菌群
- 空肠弯曲菌PEB1A蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立被引量：2
- 2017年
- 为了建立检测血清中空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)抗体的间接ELISA方法,试验通过PCR扩增并克隆空肠弯曲菌PEB1A基因,构建原核表达载体pET32a-PEB1A,将该表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达获得约47ku的可溶性目的蛋白,通过Western blotting证明所表达的重组蛋白具有良好的生物学活性。以纯化后的重组蛋白作为包被抗原,建立空肠弯曲菌抗体间接ELISA方法,对其特异性、敏感性、重复性进行检测。结果表明,本试验建立的空肠弯曲菌抗体间接ELISA检测方法临界值为0.3424,本方法仅与空肠弯曲菌阳性血清发生特异性反应,与其他抗血清无交叉反应,具有较强的特异性,批内、批间的重复性试验变异系数均<5%,具有较好的重复性和稳定性。该方法的建立可应用于血清中空肠弯曲菌抗体的快速检测,为进一步防制空肠弯曲菌腹泻提供依据。
- 王莉沙洲李诗语梁佳茗王兴龙
- 关键词：空肠弯曲菌间接ELISA原核表达
- 布鲁菌分子标记菌壳株的构建与鉴定被引量：2
- 2019年
- 旨在构建一种安全、高效的犬布鲁菌分子标记疫苗株。本试验将温控裂解部件(TLC)插入布鲁菌自杀质粒pBK-CMV-SacB-ΔB0419中,构建温控裂解型自杀质粒pBK-CMV-SacB-ΔB0419-TLC;通过电转化方式转入犬布鲁菌RM6/66感受态中,经卡那抗性和蔗糖培养基的正、负向筛选,将TLC片段定点插入布鲁菌B0419基因中,获得犬布鲁菌分子标记菌壳株。采用PCR法对连续30代次的菌株进行鉴定,结果显示裂解E基因和靶向插入位点区域(B0419基因)并未出现丢失和回复突变现象,表明该菌壳株具有良好的遗传稳定性。该菌壳株在培养至D600值为0.6时,经42℃诱导60 h后,可获得裂解率达100%的犬布鲁菌菌壳;经超薄切片和染色处理后,在透射电镜观察下可见形态完整的空心结构,其内容物明显减少。本试验结合细菌菌壳技术与同源重组技术,成功构建了具有分子标记特征的犬布鲁菌菌壳株,为新型布鲁菌疫苗的研制提供策略。
- 卜昭阳钱晶钱晶王莉屈海龙王莉屈海龙王晓旭杨艳玲王秀然王兴龙
- 关键词：分子标记同源重组候选疫苗
- 空肠弯曲菌荧光偏振抗体检测方法的建立被引量：2
- 2018年
- 为建立血清中空肠弯曲菌抗体的荧光偏振检测(FPIA)方法,本研究对空肠弯曲菌的黏附蛋白PEB1A进行原核表达。Western blot鉴定显示该重组蛋白具有良好的抗原性;FITC标记空肠弯曲菌黏附蛋白PEB1A形成示踪物,通过确定示踪物的最佳反应浓度、反应时间及血清最佳稀释度,建立空肠弯曲菌的FPIA抗体检测方法。结果显示:本实验建立的空肠弯曲菌FPIA抗体检测方法的检测标准为FP值≥150m P为阳性,FP值<150为阴性。该方法仅与空肠弯曲菌阳性血清发生特异性反应,与产肠毒素型大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌的抗血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法对抗体的最低检测效价为1∶80,批内和批间的重复性试验变异系数均小于10%,具有较好的重复性。表明本研究建立的FPIA方法为血清中空肠弯曲菌抗体的快速检测提供了一种可行的方法。
- 王莉沙洲李诗语卢晓冉卜昭阳梁佳茗王兴龙
- 关键词：空肠弯曲菌荧光标记原核表达
- ST融合蛋白的酵母表面展示及其对大鼠小肠黏膜结构的影响被引量：3
- 2018年
- 本试验旨在获得能够将大肠杆菌ST融合蛋白展示在酿酒酵母表面的重组酿酒酵母基因工程菌并探究其对大鼠小肠黏膜结构的影响。将estA和estB基因克隆至pYD1质粒中，构建重组质粒pYD1-e5tA-estB，应用酵母表面展示技术获得EBY-100／pYD1-estA-estB重组酵母基因工程菌。选取36只SPF级SD大鼠，随机分为空白对照组、工程菌组、酵母菌组，分别灌胃生理盐水、工程菌菌液、酿酒酵母菌菌液，持续灌胃21d后连续3d灌胃大肠杆菌H10407菌液，取各组大鼠的十二指肠、空肠、回肠制作切片，观察各段小肠绒毛的长度、宽度、隐窝深度及绒毛长度／隐窝深度（V／c）进行统计分析。利用EKISA、real—timePCR技术观察肠道黏膜中的SIgA、IL2、IL-4和IFN7含量变化。结果显示，通过免疫荧光试验证明大肠杆菌ST融合蛋白成功在酿酒酵母表面展示；灌胃21d时，与空白对照组相比，工程菌组及酵母菌组的十二指肠绒毛长度、v／c值显著升高（P〈0．01），工程菌组绒毛宽度显著升高（P〈0．05）；空肠绒毛长度、v／c值显著升高（P〈0．01），隐窝深度显著下降（P〈0．05）；工程菌组和酵母菌组的回肠绒毛长度及V／c值显著升高（P〈0．01）。灌胃大肠杆菌后，各组与灌胃前相比，空白对照组及酵母菌组的十二指肠与空肠绒毛长度、V／c值显著下降（P〈0．01），空肠隐窝深度显著升高（P〈0．01），回肠V／c值显著下降（P〈0．01）；工程菌组无明显变化。灌胃21d，工程菌组与酵母菌组的SIgA、IL-2、IL-4和IFN-7含量均显著高于空白对照组（P〈0．01）；攻毒大肠杆菌后，空白对照组及酵母菌组的SIgA、IL-2和IL-4含量均显著下降（P〈0．01），各组的IFN-γ含量显著升高（P〈0．01）。结果表明，EBY-100／pYD1-estA-estB重组酵母基因．72程菌不仅具有酵母菌的益生作用，能促进小肠黏膜发育，而且对�
- 沙洲李诗语卢晓冉王莉卜昭阳王兴龙
- 关键词：产肠毒素大肠杆菌酿酒酵母小肠黏膜
- 过表达UGPase基因和BCSP31基因的重组流产布氏杆菌的构建与鉴定
- 2019年
- 为提高流产布氏杆菌S19疫苗株的免疫保护效果,分别扩增流产布氏杆菌UGPase基因和BCSP31基因,将其插入含有双启动子pR/pL序列的广宿主穿梭质粒pBBR1MCS-PT中,电转至流产布氏杆菌S19感受态细胞并经抗性基因筛选,采用PCR法对重组菌株的遗传稳定性进行检测,利用蛋白分析手段对目的基因的表达情况进行分析。PCR检测结果显示,构建的重组流产布氏杆菌S19-UGPase株和S19-BCSP31株的遗传性状稳定。SDS-PAGE与Western-blot结果显示,在33和31ku处可见明显条带,且与His标签抗体的反应位置一致,表明目的蛋白获得正确表达。结果表明,构建的过表达重组流产布氏杆菌S19-UGPase株和S19-BCSP31株能够稳定表达目的基因,为下一步开展S19-UGPase株和S19-BCSP31株免疫效果的评价奠定了基础。
- 梁佳茗钱晶卜昭阳郎需龙王莉王秀然王秀然杨艳玲王晓旭屈海龙
