夏杰
- 作品数：3 被引量：3H指数：1
- 供职机构：重庆医科大学检验医学院感染性疾病分子生物学教育部重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- SH3BP4基因对肝癌细胞迁移和增殖作用的实验研究被引量：1
- 2018年
- 目的:构建SH3结构域结合蛋白4(SH3-domain binding protein 4,SH3BP4)重组腺病毒载体及shSH3BP4慢病毒载体,初步探索SH3BP4对肝癌细胞迁移增殖能力的影响。方法:PCR扩增SH3BP4 cDNA序列并构建腺病毒重组质粒pAdEasySH3BP4,HEK293细胞包装重组腺病毒AdSH3BP4;构建SH3BP4基因短发夹型RNA干扰慢病毒载体,转染至HEK293T细胞,包装重组慢病毒shSH3BP4。采用Western blot检测SH3BP4在人正常肝脏细胞及肝癌细胞的内源性表达,将SH3BP4过表达实验部分设为3个组:Mock组、AdGFP组和AdSH3BP4组,Mock组为空白对照组,AdGFP组为感染腺病毒AdGFP的对照组,AdSH3BP4组为感染腺病毒AdSH3BP4的实验组;将SH3BP4敲低实验部分设为2个组:sh Control组和shSH3BP4组,sh Control组为感染慢病毒sh PLL3.7的对照组,shSH3BP4组为感染慢病毒shSH3BP4的实验组。通过Transwell和划痕实验检测SH3BP4过表达和敲低对肝癌细胞迁移能力的影响;MTS和直接克隆形成实验检测SH3BP4过表达和敲低对肝癌细胞的增殖能力的影响。结果:经限制性内切酶酶切及DNA测序验证,成功构建AdSH3BP4重组腺病毒载体和shSH3BP4慢病毒载体。Transwell结果表明,AdSH3BP4组(74.800±0.544)相较于空白对照组(219.467±2.640)与AdGFP组(210.533±8.498),迁移的细胞数明显减少(P=0.000);而shSH3BP4组(191.467±3.906))比sh Control组(91.733±2.763)细胞的迁移数目明显增加(P=0.000)。划痕实验结果表明,AdSH3BP4组的细胞修复率[(10.400±0.036)%]明显低于空白对照组[(37.500±0.063)%]与AdGFP组[(50.000±0.063)%](P=0.000);而shSH3BP4组[(55.00±0.05)%]明显高于sh Control组[(23.3±0.029)%](P=0.000)。MTS结果表明:AdSH3BP4组在96 h的吸光度值(0.921±0.053)与空白对照组(1.091±0.043)及AdGFP组(1.062±0.024)相比明显降低(P=0.005)。shSH3BP4组在96 h的吸光度值(1.497±0.020)与sh Control对照组(1.142±0.103)相比明显升高(P=0.004)。直接克隆形成实验结果表明,AdSH3BP4组的细胞克隆形成数(34.333±2.082)
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- 关键词：肝细胞肝癌细胞迁移细胞增殖
- PCK1影响肝癌细胞迁移能力的研究被引量：2
- 2018年
- 目的:构建编码磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)的基因PCK1重组腺病毒和基因敲除2种细胞模型,并初步观察PCK1过表达和敲除后对肝癌细胞迁移能力的影响。方法:PCK1 c DNA克隆到p AdTrackTO4载体,构建重组腺病毒质粒,在HEK293细胞中包装、扩增成高滴度重组腺病毒AdPCK1;利用CRISPR/Cas9系统在PLC/PRF/5肝癌细胞系中筛选出PCK1基因敲除的稳定细胞株。首先,在过表达模型将Huh7细胞设为2组:AdGFP组和AdPCK1组,AdGFP组为感染腺病毒AdGFP的对照组,AdPCK1组为感染腺病毒AdPCK1的实验组。在敲除模型设Parental组和KO组,Parental组是PLC/PRF/5细胞作为对照组,KO组是PCK1基因敲除稳定细胞株作为实验组。Western blot技术检测2种模型蛋白表达量,采用划痕实验观察细胞迁移能力,进一步经q RT-PCR检测影响肝癌细胞的迁移关键分子。结果:重组腺病毒AdPCK1构建成功,经Western blot鉴定PCK1在Huh7细胞中的表达。向导RNA(single guide RNA,sg RNA)寡核苷酸双链成功插入酶切后的Lenti CRISPR-V2质粒载体中且测序正确;经Western blot鉴定PCK1敲除的细胞株筛选成功。划痕结果显示,PCK1过表达模型在48 h的细胞迁移率为(66.300±0.383)%,与AdGFP组[(42.900±3.833)%]相比明显增加(t=10.540,P=0.000);PCK1敲除KO组在48 h的细胞迁移率为(59.40±5.68)%,与亲本细胞组[(79.00±5.20)%]相比明显减少(t=4.420,P=0.012)。q RT-PCR结果显示,PCK1过表达后,相较于对照组AdGFP,Cdh1相对表达量为2.733±0.501(t=5.989,P=0.004),相对表达增高;PCK1敲除后,相较于亲本细胞组,Cdh1相对表达量为0.664±0.017(t=34.290,P=0.000),相对表达减少。结论:PCK1过表达后可明显抑制肝癌细胞的迁移能力,而敲除后促进其迁移,证实PCK1可能作为抑癌基因参与肝癌的发生和发展。
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- 关键词：重组腺病毒肝癌迁移
- 组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228治疗小鼠肝硬化的实验研究
- 2017年
- 目的:观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂罗米地辛(Romidepsin,FK228)对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)诱导小鼠肝纤维化模型的治疗性作用,初步探讨FK228对减轻小鼠肝纤维化的机制。方法:将30只8周龄C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组、造模组和治疗组,每组10只;对照组腹腔注射生理盐水;造模组腹腔注射10%CCl4溶液诱导肝纤维化,持续24周;治疗组在诱导纤维化第20周开始采用FK228进行治疗。检测各组小鼠血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)含量水平;对肝组织进行HE染色和天狼星红染色,观察假小叶形态结构;进行α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)免疫组化染色,观察肝星状细胞活化程度及肝纤维化进程;Western blot半定量分析α-SMA蛋白在肝脏中的表达情况。结果:造模组血清ALT(67.270±11.109)IU/L,而治疗组小鼠的血清ALT(37.670±8.461)IU/L显著下降(P=0.019);肝组织切片HE染色和天狼星红染色显示造模组纤维化程度高、假小叶形成明显,而治疗组纤维化程度明显减弱;免疫组化染色和Western blot结果显示治疗组α-SMA水平相对于造模组明显降低(P=0.001)。结论:研究结果首次证实FK228对降低小鼠肝纤维化程度有治疗性作用,而且其机制可能与抑制星状细胞活化和降低α-SMA蛋白表达水平有关。
- 李梦辉周恒宇刘迪娜蔡莹龚建平唐霓黄爱龙夏杰
- 关键词：组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228肝纤维化Α-平滑肌肌动蛋白
