张峰
- 作品数：16 被引量：36H指数：4
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- 重组猪β防御素-2在大肠杆菌中的融合表达及抑菌活性分析
- 2012年
- 猪β防御素-2(porcine beta-defensin-2,pBD-2)是猪体内重要的天然抗菌肽,具有广谱抗菌活性,在动物抗菌饲料添加剂中有潜在的应用前景。为在原核表达系统中制备重组猪β防御素-2,我们首先利用Trizol试剂从猪血白细胞中提取总RNA,然后通过RT-PCR的方法,扩增得到pBD-2基因,并通过EcoRI和NotI酶切位点将其插入到原核表达载体pET-32a(+)上。
- 张峰仲飞李秀锦李巍刘龙飞李凌李楠
- 关键词：Β防御素DEFENSIN活性分析ECORI广谱抗菌活性
- 犬白细胞介素-7基因对犬细小病毒DNA疫苗的免疫增强作用被引量：6
- 2012年
- 【目的】白介素-7是动物体一种重要的多功能细胞因子,在促进B细胞、T细胞的形成和发育,在协同其它细胞因子提高机体免疫能力等方面发挥重要作用。本试验利用犬细小病毒VP2 DNA疫苗,在小鼠体内分析了犬白介素-7(cIL-7)基因的免疫增强作用。【方法】采用RT-PCR方法从犬脾淋巴细胞中扩增cIL-7基因,然后将cIL-7基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,分别构建成与Myc/His标签融合和非融合的cIL-7真核分泌型表达载体pcDNA-cIL7/MH和pcDNA-cIL7。由磷酸钙介导将pcDNA-cIL7/MH质粒转染HEK 293T细胞使其进行瞬时表达,以Western-blot检测构建的表达载体能否介导cIL-7基因在真核细胞中进行分泌表达。用已构建的VP2表达载体pcDNA-CD5-VP2与pcDNA-cIL7载体共免疫小鼠,并设pcDNA-CD5-VP2单免疫小鼠和pcDNA-cIL7单免疫小鼠作为对照。免疫后通过ELISA方法检测抗体水平,并通过淋巴细胞增殖实验和ELISA方法分别检测免疫后35 d小鼠脾脏淋巴细胞刺激指数和γ-干扰素的表达水平。【结果】本试验扩增的cIL-7基因序列与GenBank中犬的序列完全一致。构建的表达载体能够介导cIL-7基因在HEK293T细胞中进行分泌表达。动物免疫试验结果显示,cIL-7与VP2共免疫组小鼠血清的抗体滴度和中和抗体效价分别极显著和显著高于VP2单免疫组(P<0.01和P<0.05);共免疫组小鼠淋巴细胞刺激指数和γ-干扰素表达水平也显著高于VP2单免疫组(P<0.05)。【结论】cIL-7基因可增强小鼠对VP2 DNA疫苗的免疫应答反应。
- 孙岩仲飞李秀锦王幸兴王璐贾启恒韩冬梅李振张峰潘红丽
- 关键词：细小病毒VP2基因DNA疫苗
- 小鼠GM-CSF基因的扩增及在HEK293T细胞中的分泌表达
- 2012年
- 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是机体免疫系统的重要细胞因子,具有生物佐剂作用。为了研究GM-CSF的生物佐剂作用,本实验构建了真核分泌性表达载体,并在真核细胞内进行分泌性表达,最终获得了重组GM-CSF蛋白。首先通过RT-PCR的方法从小鼠脾脏细胞中扩增获得小鼠GM-CSF基因,然后通过KpnⅠ和ApaⅠ双酶切位点,将目的片段插入到pcDNA3.
- 李楠张峰温洁霞仲飞
- 关键词：分泌表达小鼠脾脏机体免疫系统重组表达载体动物疫苗
- 重组猪肺表面活性蛋白A在体外可抑制PRRSV感染宿主细胞
- 2012年
- 表面活性蛋白A(SP-A)是动物肺泡表面重要的天然防御物质。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的宿主细胞是猪肺泡巨噬细胞(PAM),SP-A是否对PRRSV的感染有影响尚不清楚。为此本文通过制备重组SP-A在体外分析了SP-A对PRRSV感染的影响。首先采用PCR方法从含有猪SP-A基因的质粒中扩增SP-A基因。
- 张峰仲飞李秀锦王幸兴张考陈慧慧李振李文艳潘红丽韩冬梅
- 关键词：宿主细胞PRRSV感染肺表面活性蛋白肺泡巨噬细胞信号肽序列分泌型表达载体
- 犬细小病毒NS1非结构蛋白可诱导细胞凋亡被引量：8
- 2012年
- 【目的】研究犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)非结构蛋白NS1在CPV引起宿主细胞凋亡中的作用,初步探讨CPV引起细胞凋亡的机制。【方法】首先采用PCR方法从犬细小病毒基因组中扩增NS1编码基因,然后利用pcDNA3.1A质粒构建NS1真核表达载体pcDNA-NS1,并通过HEK293FT细胞瞬时表达NS1重组蛋白,用Western-blot检测以确定重组NS1蛋白能否在真核细胞中表达。然后用CPV感染和用pcDNA-NS1表达载体转染F81宿主细胞,通过AnnexinV/PI双染法检测磷脂酰丝氨酸外翻和通过化学发光法检测caspase-3/7活性,分析感染CPV或转染NS1基因对F81宿主细胞凋亡的影响。【结果】结果表明,本实验扩增的NS1基因序列与GenBank的序列一致,构建的表达载体结构正确,并能够介导NS1基因在真核细胞中表达。感染CPV和转染NS1基因均能诱导F81细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻和明显提高细胞内caspase-3/7的活性,表明CPV和NS1蛋白均能引起细胞的凋亡。【结论】CPV诱导宿主细胞凋亡与其编码的NS1非结构蛋白有关。
- 潘红丽仲飞潘素敏李秀锦张峰张考陈慧慧
- 关键词：犬细小病毒NS1蛋白细胞凋亡
- 重组猪蛔虫抗菌肽cecropin P1在毕赤酵母中的表达及抑菌活性
- ＜正＞为在毕赤酵母中表达重组猪蛔虫抗菌肽cecropin P1,根据已发表的基因编码序列设计引物,采用RT-PCR方法从猪肠道蛔虫中扩增出cecropin P1基因,并将其插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K中α-因子信...
- 李巍仲飞李秀锦张峰刘龙飞王幸兴潘素敏韩冬梅
- 文献传递
- 小鼠GM-CSF基因的扩增及在HEK293T细胞中的分泌表达被引量：2
- 2012年
- 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是机体免疫系统的重要细胞因子,具有生物佐剂作用,为研究GM-CSF的生物佐剂作用,本试验通过RT-PCR方法从小鼠脾脏细胞中扩增小鼠GM-CSF的cDNA,并将其插入到pcDNA3.1质粒中,构建成GM-CSF真核表达载体pcDNA3.1-GMCSF,并在真核细胞进行了瞬时表达。结果表明,本研究扩增的小鼠GM-CSF基因序列与GenBank序列完全一致,表达载体经脂质体介导转染HEK293T细胞,表达产物经western-blot检测,证明GM-CSF能够在HEK293T细胞中进行分泌表达。这为今后研究GM-CSF在动物疫苗,特别是DNA疫苗中的生物佐剂作用创造了必要的条件。
- 李楠张峰仲飞
- 关键词：基因扩增
- 重组猪肺表面活性蛋白A在体外可抑制PRRSV感染宿主细胞被引量：8
- 2012年
- 【目的】研究重组猪肺表面活性蛋白A(SP-A)在体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的抑制作用。【方法】采用PCR方法从含有猪SP-A基因的质粒中扩增SP-A基因,并将其插入到含有人CD5信号肽序列的真核表达载体pcDNA3.1A-CD5中,构建成SP-A基因的真核分泌型表达载体pcDNA-CD5-SPA/MH。将重组表达载体通过磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行瞬时表达,通过Western blot方法鉴定表达产物,采用Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析法从培养基中分离和纯化重组SP-A蛋白,通过ELISA方法检测SP-A蛋白与PRRSV的结合活性。将SP-A蛋白与PRRSV孵育,然后感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞,感染72 h后测定病毒滴度,分析重组SP-A蛋白对PRRSV感染的抑制作用。【结果】结果表明构建的真核表达载体能够介导SP-A基因在HEK293T细胞中进行分泌表达;表达的重组猪SP-A蛋白能够与PRRSV进行剂量依赖性结合;用重组猪SP-A蛋白与PRRSV进行孵育,然后感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞,结果显示SP-A处理的PRRSV感染细胞后的病变程度明显低于对照组。感染72 h后,SP-A处理组的PRRSV在MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞的滴度明显低于SP-A非处理组。【结论】重组猪SP-A在体外对PRRSV的感染有明显的抑制作用,揭示SP-A具有抗PRRSV的活性。
- 张峰仲飞李秀锦王幸兴张考陈慧慧李振李文艳潘红丽韩冬梅
- 关键词：抗病毒活性猪繁殖与呼吸综合征病毒真核表达
- 重组大肠杆菌不耐热肠毒素的表达及对小鼠胚胎稳定性的影响被引量：3
- 2012年
- 为研究大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)对小鼠胚胎稳定性的影响,运用大肠杆菌表达系统制备了具有生物活性的重组大肠杆菌LT,用重组LT通过腹腔注射处理妊娠小鼠,分析了LT对小鼠胚胎稳定性的影响。首先采用PCR方法从产毒大肠杆菌菌株44815基因组中扩增LT的A、B亚基基因,将其插入到pET-20b(+)原核表达载体pelB信号肽的下游,分别构建成LTA和LTB分泌型表达载体;将载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,在IPTG的诱导下进行表达,利用Ni-NTA琼脂糖凝胶从细菌周质释放液中提取和纯化重组LTA和LTB蛋白;利用细胞毒性试验检测重组蛋白的生物活性。然后用制备的重组LT注射妊娠6d的小鼠,连续注射3d后,统计小鼠的胚胎存活率。同时用ELISA方法检测小鼠血清中与胚胎稳定性密切相关的Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-2)和Th2型细胞因子(IL-4、IL-10)及IL-β的表达水平。结果表明,采用分泌性表达策略实现了重组LT在大肠杆菌中的高效分泌表达,LTA和LTB的表达量分别达68、62mg/L。表达的重组LT具有明显的细胞毒性作用;用LT处理妊娠小鼠,胚胎的存活率为32%,明显低于对照组;小鼠血清中Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2的含量明显高于对照组(P<0.01),分别为对照组的2、3倍。同时细胞因子IL-1β为对照组的2倍(P<0.01),而稳定胚胎发育的Th2型细胞因子IL-4、IL-10没有明显变化(P>0.05)。据此推测,LT可能与大肠杆菌性肠炎引起妊娠家畜流产有关,LT对胚胎稳定性的影响除与LT的直接毒性有关外,可能还与LT介导的免疫调节异常有关。
- 韩冬梅仲飞李秀锦王淼李文艳张峰潘红丽谢南王璐
- 关键词：原核表达细胞毒性细胞因子
- 小鼠GM-CSF基因的扩增及在HEK293T细胞中的分泌表达
- 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是机体免疫系统的重要细胞因子,具有生物佐剂作用。为了研究GM-CSF的生物佐剂作用,本实验构建了真核分泌性表达载体,并在真核细胞内进行分泌性表达,最终获得了重组GM-CSF蛋白...
- 李楠张峰温洁霞仲飞
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