张荣建
- 作品数：13 被引量：20H指数：3
- 供职机构：中国食品药品检定研究院更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项国家科技支撑计划中央级公益性科研院所基本科研业务费专项更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学生物学更多>>
- G亚属猴腺病毒荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用
- 2012年
- 目的建立G亚属猴腺病毒(simian adenovirus,SAdV)特异的荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法,并研究实验猴群和猴源性生物制品中SAdV感染或污染情况。方法根据G亚属SAdV基因保守区,设计特异性引物和TaqMan探针。制备重组质粒pGEM-TEasy-SAdVpol标准品,建立标准曲线。经灵敏度、特异性、准确性和重复性评价后,检测33份猴粪便样本和4批次脊髓灰质炎疫苗。结果建立的FQ-PCR检测方法特异检测G亚属,与A、F亚属无交叉反应,准确性及重复性较好。标准曲线相关系数0.999,线性范围6lg(60～6×106拷贝),最低检出限可达6拷贝/μl。33份猴粪便样本中15份为阳性(45.5%),4批脊髓灰质炎疫苗均为阴性。结论建立的FQ-PCR检测方法可定量检测G亚属SAdV拷贝数,初步应用表明我国实验猴群中G亚属SAdV流行率较高,应加强监测避免人类感染的潜在风险。
- 张荣建贺争鸣
- 关键词：荧光定量PCR
- 利用高分辨液相质谱综合表征抗CTLA4单克隆抗体的研究被引量：3
- 2020年
- 目的研究建立抗CTLA4单抗质谱表征方法。方法以抗CTLA4单抗为研究对象,利用液相色谱-串联质谱联用技术(LC-MS/MS),通过优化液相条件与质谱参数,应用液质联用技术从完整蛋白相对分子质量、亚基相对分子质量、氨基酸序列覆盖率、二硫键、糖基化位点、W糖基化修饰等方面对抗CTLA4单抗进行全面的表征。结果抗CTLA4单抗完整相对分子质量(主要糖型,A2G0F/A2G0F)约为147992;去糖完整相对分子质量为145103;轻链相对分子质量为23450,重链相对分子质量(主要糖塑,A2G0F)为50548;重链Fd段相对分子质量为25355,重链sFc段(A2G0F,lxK_Loss)25189。使用Trypsin&Chymotrypsin分别进行蛋白酶解,单抗氛基酸序列覆盖率为100%;16对二硫键全部得到鉴定,与理论二硫键连接方式一致;N糖基化修饰所在的肽段序列为EEQYNSTYR,N-糖基化修饰位点位于重链的第298位天冬酰胺残基上,有13种主要糖塑,包括A2G0F(59.8%)、A2GlFa(18.66%)、A2GlFb(7.28%)、A2G2F(3.2%)、M5(1.66%)、A2S1G0F(1.17%)、A1G0F(1.16%)、A3G1F(0.95%)、A2G0(0.94%)、A2S2F(0.78%)、A2S1G1F(0.67%)、A3G0F(0.53%)和A1G1F(0.51%)。结论建立了基于质谱技术对CTLA4单抗系统的表征分析方法。
- 武刚王文波于传飞崔永菲张荣建王兰
- 关键词：相对分子质量二硫键
- NSO细胞DNA首批国家标准品的建立
- 2020年
- 目的建立小鼠骨髓瘤NSO细胞DNA含量测定国家标准品。方法使用QIAGEN基因组DNA纯化试剂以及Genomictip 500/G制备了NSO细胞DNA作为标准物质原料。通过紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳进行纯度和含量测定,每支100μL分装于螺口冻存管。组织5个独立实验室应用紫外分光光度法对我国第一批NSO DNA国家标准品进行协作标定,并评价DNA标准物质的稳定性与适用性。结果所制备的NSO细胞DNA标准品经检测,A260/A280均在1.7~1.9之间,电泳图谱条带单一,纯度符合要求。该DNA标准品经5家实验室协作标定共90次,几何平均含量为87.5μg·mL^-1,平均含量的95%可信区间为86.6~88.5μg·mL^-1。短期稳定性实验表明,该标准品在4℃条件下放置4个月,DNA标准品浓度测定值及/1260/无显著性差异;-20、-70℃贮存1年的长期稳定性结果显示,标准品DNA浓度测定值及A260/A280无显著性差异,电泳条带单一,因此该标准物质应在-20℃条件以下长期保存。在标准品适用性研究中,利用该标准品进行定量PCR法测定,在3 fg·μL^-1~300 pg·μL^-1之间线性良好,标准曲线r^2值>0.999。结论该批NSO DNA国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品用于定量PCR法检测NS0细胞DNA残留量,DNA标准品含量赋值为87.5μg·mL^-1,批号为330002-201701。
- 武刚付志浩崔永霏张荣建王兰
- 关键词：国家标准品
- 定量PCR-Taqman探针法检测NS0宿主细胞残留DNA的方法学验证被引量：1
- 2019年
- 目的NS0宿主细胞残留DNA检测(定量PCR-Taqman探针法)方法的验证。方法针对小鼠骨髓瘤细胞(NS0)基因组重复序列设计合成多对引物、探针,通过实验优选最佳的引物探针组合;应用所建立的前处理试剂盒(磁珠法)对供试品中宿主细胞残留DNA进行富集纯化;根据《国际人用药品注册技术协调会(ICH)》及《中国药典》通则9101的要求,应用所建立的NS0宿主细胞DNA残留检测试剂盒进行线性与范围、准确度、精密度、专属性、定量限的方法学验证。应用NS0细胞生产的单克隆抗体工艺中间品及原液,验证所建立试剂盒对实际生产样品的检测性能,并组织5个独立实验室进行协作标定。结果 NS0细胞DNA检测(Taqman法)正向引物序列:CCCCTTCAGCTCCTTGGGTA、反向引物序列:GCCTGGCAAATACAGAAGTGG、荧光探针序列:FAM-AGGGCCCCCAATGGAGGAGCT-TAMRA;NS0细胞DNA标准曲线在3 fg·μL^-1~300 pg·μL^-1内,线性良好(r2> 0. 99);对6个浓度梯度检测的准确度偏差均<15%;定量限为3 fg·μL^-1;内部参考品DNA标定结果为30μg·m L^-1;精密度良好(RSD≤30%);能特异性地检测NS0细胞DNA,对大肠杆菌DNA、人类基因组DNA(人肾上皮293T细胞)、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞DNA无扩增反应。另外,对于生产工艺中间品及原液的检测回收率均在70%~130%,RSD均<15%。5个独立实验室间协标检测数据RSD均<30%。结论自主研发NS0宿主细胞DNA残留检测试剂盒(定量PCR-Taqman探针法)特异性强、灵敏度高、准确度好,能够满足NS0宿主DNA残留检测要求。
- 武刚付志浩杨志行崔永霏张荣建宗伟英王兰
- 猴腺病毒(SAdV)PCR检测方法的建立及初步应用被引量：1
- 2012年
- 目的建立SAdV特异的PCR检测方法并研究实验猴群和猴源性生物制品中SAdV感染或污染情况。方法比对分析多株SAdV序列,设计SAdV特异引物,优化PCR实验条件,建立的PCR方法经验证后检测实验猴群和猴源性生物制品,阳性产物测序并构建进化树。结果经特异性和敏感性鉴定,在设计的5对引物中确定一对最佳引物,可以区分SAdV和MAD,ICH,CELO且可以检测到的最小DNA量为47.9 pg/mL。PCR方法检测实验猴群,阳性率49.2%,测序及进化分析表明,SAdV感染型别呈广泛基因多样性。主要分布在G亚属和以SAdV-49为代表的分支。结论经测序验证,PCR检测方法具有很好准确性,初步应用表明我国实验猴群中SAdV高度流行,应加强实验猴群及相关生物制品中SAdV的监测,避免人类感染SAdV的潜在风险。
- 张荣建贺争鸣
- 关键词：PCR
- 猴腺病毒GD株的分离与鉴定
- 2012年
- 目的体外分离出猴腺病毒(simian adenovirus,SAdV)毒株,并对其进行鉴定,为SAdV的生物学特性、致病机制和诊断试剂等方面的研究提供基础。方法采用PCR法对猕猴粪便样本进行SAdV筛查,将PCR检测为阳性的样本处理后接种BSC-1细胞,盲传3代后用PCR扩增测序并负染色电镜观察。结果从广东地区食蟹猴粪便样本中成功分离出一株SAdV,细胞病变明显,PCR检测呈阳性,电镜下可观察到典型腺病毒样形态的病毒粒子,命名为GD株。经测序鉴定,发现GD株属HAdV-G亚属,与SAdV-1进化发生距离最近。结论 GD株的分离成功,使猴腺病毒基因转移载体的构建成为可能,有助于猴腺病毒替代载体的发展。
- 张荣建付瑞贺争鸣
- 关键词：同源性分析
- 猴腺病毒检测方法的建立与初步应用
- 猴腺病毒（Simian Adenovirus,SAdV）属于哺乳动物腺病毒属，与人腺病毒亲缘关系很近，曾在生产用猴肾细胞和脊髓灰质炎减毒疫苗检定中分离出一些SAdV毒株[1、2]。SAdV在实验猴群中高度流行，并存在变种...
- 张荣建
- 关键词：聚合酶链式反应荧光定量PCR技术间接免疫荧光试验病毒分离
- 文献传递
- 以Delta样蛋白3为靶点的抗体偶联药物质量研究被引量：4
- 2019年
- 目的建立一种基于半胱氨酸偶联方式的抗体偶联药物抗Delta样蛋白3 (DLL3)单抗-MPVP-PBD的质控方法。方法本实验利用转基因细胞法,以转染了DLL3的HEK 293T细胞系为靶细胞测定抗DLL3单抗-MPVP-PBD的生物学活性;利用ELISA法测定结合活性;利用CE-SDS和SEC-UPLC测定大小异质性;利用i CIEF分析电荷异质性;分别利用HIC-HPLC和LC-MS对药物抗体偶联比(drug-to-antibody ratio,DAR)进行测定;利用RP-HPLC测定游离小分子药物含量。结果抗DLL3单抗-MPVP-PBD的生物学活性EC50平均值为(4. 02±0. 22) ng·m L^-1,RSD为5. 47%;结合活性EC50平均值为(12. 67±1. 09) ng·m L^-1,RSD为8. 60%;非还原CE-SDS完整Ig G峰面积百分比为(25. 58±0. 15)%、HHL为(36. 56±0. 24)%、轻链为(14. 61±0. 13)%等,RSD均小于2%;还原CE-SDS重链和轻链峰面积之和为(96. 97±0. 31)%,RSD为0. 32%;SEC-UPLC主峰面积为(98. 68±0. 05)%,多聚体(1. 32±0. 05)%,RSD均小于5%;i CIEF主峰面积为(68. 19±0. 68)%,主峰等电点(8. 28±0. 01),RSD均小于2%;LC-MS测定DAR为2. 08(完整相对分子质量水平)和1. 73(轻重链水平);HIC-HPLC测定DAR为(1. 86±0. 03),0-药物为(19. 49±0. 28)%,1-药物为(11. 21±0. 20)%,2-药物为(48. 64±0. 68)%,3-药物为(5. 21±0. 40)%,4-药物为(15. 44±1. 19)%,RSD均小于10%;LC-MS测定了偶联位点占有率;RP-HPLC测定游离小分子药物为(23. 20±0. 82)%,RSD为3. 53%。结论本实验初步建立了抗体偶联药物抗DLL3单抗-MPVP-PBD的质控方法,该质控方法具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,可作为其常规检测方法,为我国相关抗体偶联药物的质量检测提供了参考依据。
- 李萌孙亮朱磊于传飞王文波武刚张荣建崔永霏王兰
- 关键词：生物学活性
- 猴腺病毒研究进展被引量：1
- 2011年
- 猴腺病毒(simian adenovirus,SAdV)是猴类呼吸道和消化道的常在病毒之一,可引起肺炎、咽炎、肠胃炎、结膜炎等以粪口途径传播为主,主要感染猕猴、非洲绿猴、黑猩猩和狒狒等[1]属腺病毒科,哺乳动物腺病毒属。有学者认为SAdV感染有严格的种属特异性[1],也有报道认为其种间交叉传播在非人灵长类中可能普遍发生,是动物传染病似的感染[2、3]。SAdV是否感染人类尚未见报道,但已从猴的分泌物中发现了可能和人腺病毒(humanadenovirus,HAdV)发生重组的新型腺病毒[4]。SAdV与HAdV亲缘关系很近,感染引起的临床症状也相似,是人腺病毒研究的理想模型。目前已经制定了研发猴腺病毒模型的目标,用于研究感染机制,促进腺病毒基因治疗和疫苗开发进程[3]。但猴腺病毒自然感染流行情况的研究依然很少。本文将就SAdV的发现与分类、生物学特性、感染特点及检测方法做一综述,为研究者提供一些有用参考。
- 张荣建贺争鸣
- 关键词：生物学特性PCR
- 抗PD-L1单抗的质量控制研究被引量：8
- 2019年
- 目的:研究建立抗程序性死亡受体配体1(programmed cell death protein ligand 1,PD-L1)单抗的质量控制方法。方法:利用成像毛细管等电聚焦电泳(imaging capillary isoelectric focusing electrophoresis,iCIEF)、肽图对抗PD-L1单抗进行鉴别;利用还原/非还原十二烷基磺酸钠毛细管电泳(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate,CE-SDS)、分子排阻高效液相色谱(size exclusion-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)、离子交换高效液相色谱(ion exchange-high performance liquid chromatography,IEC-HPLC)对抗PD-L1单抗的纯度进行控制;利用细胞结合抑制法和转基因细胞法测定抗PD-L1单抗的活性;利用光阻法和液流成像分析法对不溶性微粒进行检测和分析。结果:抗PD-L1单抗的iCIEF检测结果具有特征性主峰,肽图检测具有相应特征峰,起到很好的鉴别作用。还原CE-SDS的轻链与重链峰面积之和的百分比为(98.37±0.21)%,非还原CE-SDS主峰峰面积百分比为(96.33±0.15)%;SEC-HPLC单体的峰面积百分比为(99.43±0.02)%;IEC-HPLC酸性区峰面积百分比、主峰峰面积百分比、碱性区峰面积百分比分别为(13.63±0.40)%、(80.00±0.36)%、(6.37±0.15)%。细胞结合抑制法与转基因细胞法的活性检测均呈现剂量反应曲线,反映抗PD-L1单抗剂量依赖性地阻断程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)与PD-L1的结合及后续的生物学效应。光阻法检测≥10μm及≥25μm的不溶性微粒数分别为(1.33±0.58)粒·mL^(-1)和(0.00±0.00)粒·mL^(-1);液流成像分析法检测2～10μm、≥10μm及≥25μm的微粒数分别为(1 243.67±242)粒·mL^(-1)、(45.67±16.07)粒·mL^(-1)和(10.00±5.00)粒·mL^(-1),其中,蛋白聚体占87.45%,非蛋白聚体占12.55%。结论:研究建立了抗PD-L1单抗的多种质控方法,为国内抗PD-L1单抗的质量检测提供了参考依据。
- 郭莎王开芹武刚李萌崔永霏俞小娟张荣建于传飞王兰
- 关键词：纯度测定
