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斑马鱼notch3基因真核表达载体的构建及其表达分析被引量：1: 2022年; 为了进一步研究notch3基因在斑马鱼中的功能,构建了斑马鱼notch3真核表达载体并在真核细胞中成功表达。其中斑马鱼notch3基因编码序列(coding sequence,CDS)从NCBI的在线数据库中获得,根据序列克隆其胞内段(notch intracellular domain,NICD),接着利用同源重组技术构建pCMV-N3ICD表达载体。再通过双酶切和测序筛选阳性重组载体,借由脂质体法转染至HEK293T细胞中,最后经细胞免疫荧光技术和蛋白质印迹法验证N3ICD的表达。结果显示,重组质粒经酶切电泳片段及测序比对均与预期结果一致。在蛋白质印迹实验中N3ICD蛋白可正常表达,且大小与预测结果一致。细胞免疫荧光显示重组质粒可以在HEK293T细胞的细胞核中表达。同时,构建的N3ICD真核表达载体能够明显增强NF-κB(nuclear factor-кB)家族中rela和nfκb1启动子的活性。成功构建了pCMV-N3ICD真核表达载体。; 吴坤坤徐行徐行季策李伟明任建峰; 关键词：斑马鱼 NOTCH3 免疫荧光真核表达载体

两种LD_(50)计算方法对副溶血性弧菌毒力的比较研究被引量：10: 2016年; 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是目前备受关注的人畜共患病的病原。为了比较7株不同来源的Vp对斑马鱼的毒力大小及致病能力,采用急性毒性试验测定96 h内Vp对斑马鱼的半数致死剂量(median lethal dosage,LD_(50)),用累积法和Bliss法对比分析LD_(50)指标。结果显示:Vp KNH1无致病性。其他菌株感染后,均表现出腹部出血,腹腔有腹水,内脏出血等症状。用累积法和Bliss法分析人类致病菌株ATCC17802、ATCC33847及水生动物致病菌株Vp13、Vp31、Vp41、Vp57共6株不同来源的副溶血性弧菌的LD_(50),累积法计算得到的LD_(50)分别为6.0×107、7.4×107、3.9×107、1.6×108、1.6×108、9.3×107CFU/m L;Bliss法得到的LD_(50)分别为:5.0×107、7.6×107、3.6×107、1.5×108、1.6×108、9.4×107CFU/m L。研究结果发现两种计算方法得出的LD_(50)数值差距较小,结果相似,不同菌株毒力强弱的顺序均为:Vp13>ATCC17802>ATCC33847>Vp57>Vp31≥Vp41>Vp KNH1。综上所述,累积法及Bliss法均可用于检测细菌毒力大小,但由于计算机的发展使得Bliss计算方法更加简便,为更优的选择。; 董雪红田敏季策马文元张庆华; 关键词：副溶血性弧菌斑马鱼 LD50 累积法

斑马鱼notch1a对pka报告基因转录调控作用: 2021年; 目的通过双荧光素酶报告基因研究斑马鱼notch1a对pka的转录调控作用。方法利用NCBI数据库获得斑马鱼notch1a基因序列,克隆notch1a基因的胞内段NICD(Notch intracellular domain),构建pCMV-N1aICD表达载体,利用蛋白质印迹法检测N1aICD蛋白的表达水平;利用加州大学圣克鲁兹分校基因组浏览器数据库获得斑马鱼pka基因的启动子序列,构建pGL3-pka报告基因载体,然后在HEK293T细胞系中证实构建的报告基因载体具有活性;将重组荧光素酶报告载体和N1aICD表达载体共转染HEK293T细胞,用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性,验证notch1a胞内段对pka基因转录水平的调控作用。结果经测序验证克隆成功后,蛋白质印迹法检测N1aICD蛋白能够正常表达,且蛋白大小与预测结果一致。双荧光素酶报告基因显示,pGL3-pka组活性为pGL3空载组的3.25倍。转染pGL3-pka和pCMV-N1aICD组活性为转染pGL3-pka和pCMV空载对照组的0.31倍。结论斑马鱼notch1a对pka启动子具有转录抑制作用。在骨形成和骨重建中,Notch通路可能通过调控pka来参与成骨与破骨细胞的分化。; 张颖张颖季策李伟眀任建峰; 关键词：斑马鱼骨质疏松 PKA

斑马鱼幼鱼嗜中性粒细胞对副溶血弧菌清除的动态变化被引量：1: 2020年; 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是人-兽-鱼共患的致病菌,严重威胁食品安全和人类的健康。为了研究宿主嗜中性粒细胞清除细菌感染的动态变化过程,利用红色荧光蛋白标记的副溶血弧菌Vp57RFP菌株感染受精后48 h(hours post fertilization,hpf)的斑马鱼(Danio rerio)幼鱼耳泡,建立局部感染模型,并以大肠杆菌(Escherichia coli)Ec01菌株为对照,系统比较了副溶血弧菌和大肠杆菌的半数致死剂量(median lethal dose,LD50)、存活曲线以及和嗜中性粒细胞相互作用的动态过程,RT-qPCR验证炎症相关基因il1b和il10在感染前后的表达量变化。结果显示副溶血弧菌和大肠杆菌感染斑马鱼幼鱼的LD50分别为7.90×10^8 CFU/mL和1.14×10^11 CFU/mL,与感染大肠杆菌相比,斑马鱼感染副溶血弧菌后招募嗜中性粒细胞的速度更快,且数量更多。RT-qPCR结果发现斑马鱼感染副溶血弧菌后在相同时间点能够激活更高的il1b和il10基因的表达,引起强烈的炎症反应。基于以上研究,我们建立的副溶血弧菌-斑马鱼幼鱼耳泡局部感染模型,为进一步研究嗜中性粒细胞清除副溶血弧菌感染的动态过程,以及深入揭示天然免疫应答机制提供了依据。; 郭欣娅季策季策季帆祖尧任建峰任建峰; 关键词：副溶血弧菌斑马鱼嗜中性粒细胞天然免疫

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