潘新华
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
- 供职机构：华东师范大学生命科学学院生命医学研究所更多>>
- 发文基金：中央高校基本科研业务费专项资金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- G蛋白偶联受体56胞外端融合蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备
- 2011年
- 目的：制备G蛋白偶联受体56（G protien-coupled recepter 56,GPR56）的高效抗体,为其功能及分子机制的深入研究提供灵敏、高效的免疫学检测工具。方法：以肝癌细胞株MHCC-97H的cDNA为模板,利用PCR技术扩增GPR56 N端序列（661~1 073 bp）,并构建重组表达载体pGEX4T-1-GPR56N。阳性克隆经酶切、测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达。表达产物经Western blot初步鉴定后,用GST磁珠分离纯化,纯化后蛋白与免疫佐剂混合直接免疫家兔制备抗血清。阳性血清用ELISA、Western blot、免疫组织化学等技术对细胞或组织中的GPR56进行鉴定和分析。结果：成功构建重组表达载体pGEX4T-1-GPR56N,GPR56N与GST的融合蛋白（GST-GPR56）在原核系统中进行了高效的可溶性表达,制备的兔抗人GPR56抗体经Western blot和免疫组织化学分析结果表明,该抗体可同时对人源性和鼠源性的GPR56进行特异性检测。结论：成功对GPR56蛋白N端序列进行了原核表达和纯化,制备的抗GPR56多克隆抗体具有较高的特异性,为GPR56功能及分子机制的深入研究奠定了坚实的基础。
- 赵去非韩红辉刘俊晨潘新华汪磊钱旻杜冰
- 关键词：GST原核表达多克隆抗体
- P2Y6稳定干扰乳腺癌细胞系的建立及其增殖能力评价被引量：1
- 2012年
- 目的:应用shRNA技术,构建P2Y6基因稳定干扰的乳腺癌细胞株,为P2Y6调控乳腺癌发生发展的功能及机制研究奠定基础。方法:以人P2Y6基因为靶序列,设计并合成干扰序列,并将其插入经EcoR I和Age I酶切的PLKO线性化质粒。阳性克隆经EcoRⅠ和NdeⅠ酶切、测序正确后与ps-PAX2、pMD2.G和PLKO重组慢病毒载体共转染293T细胞,包装成完整病毒。病毒经富集后感染乳腺癌细胞BT549,经嘌呤霉素筛选P2Y6稳定干扰的乳腺癌细胞。通过RT-PCR、Western blot等方法检测P2Y6的干扰效率。最后通过MTS实验对P2Y6基因稳定干扰后乳腺癌细胞的增殖能力进行评价。结果:阳性克隆经DNA测序后与预期相符。稳定转染P2Y6shRNA的BT549细胞中P2Y6的mRNA和蛋白表达水平与对照组细胞相比明显下降。P2Y6基因干扰后乳腺癌细胞的增殖能力没有显著变化。结论:成功构建人P2Y6基因表达稳定干扰的乳腺癌细胞株BT549。P2Y6的表达与乳腺癌细胞增殖无明显相关性。
- 杨林立李瑞梅潘新华钱旻杜冰
- 关键词：SHRNA慢病毒增殖乳腺癌细胞
