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艰难梭菌毒素蛋白表达与艰难梭菌感染分级关系的研究被引量：4: 2018年; 目的分析医院艰难梭菌感染(clostridiumdifficile infection,CDI)患者的临床表现与实验室检查结果,初步研究艰难梭菌毒素蛋白表达与CDI严重程度分级的关系。方法收集2016年3月-2017年5月医院连续采集的860例腹泻便样本,采用Techlab Cdiff Quik Check Complete试剂盒和艰难梭菌毒素基因试剂盒分别检测艰难梭菌谷氨酸脱氢酶抗原(Clostridium difficile glutamate dehydrogenase antigen,GDH)、艰难梭菌毒素蛋白和艰难梭菌毒素基因,并对CDI患者临床资料和实验室结果进行统计分析。结果 860份腹泻样本中,GDH阳性99例占11.51%,其中艰难梭菌毒素蛋白阳性16例占16.16%,毒素基因阳性94例占94.95%;艰难梭菌毒素蛋白阳性患者的外周血白细胞数量、血清肌酐水平、腹泻次数、CDI分级指数及院内CDI患者概率均高于毒素蛋白阴性患者(P<0.05)。结论艰难梭菌毒素蛋白阳性患者常伴随严重的艰难梭菌感染临床表现,推测艰难梭菌毒素蛋白可作为一项重度艰难梭菌感染的预测指标,为临床判断CDI分级及合理选择治疗方案提供及时客观的依据。; 王丽倩罗芸许星星黄忱吴盛海管福强金大智王贤军; 关键词：艰难梭菌毒素蛋白

艰难梭菌毒素A和毒素B羧基端抗原区段的表达及抗原性分析被引量：2: 2015年; 目的构建艰难梭菌毒素A和毒素B的原核表达载体,获得融合表达抗原,并鉴定其抗原活性。方法以ATCC43255菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得毒素A和B羧基端(C端)基因片段,并进行原核表达获得毒素A和B羧基端抗原区段。利用艰难梭菌毒素检测试剂盒对毒素A和B羧基端抗原区段的抗原性进行鉴定。结果成功构建了艰难梭菌毒素A和毒素B的原核表达载体,并获得能被相应特异性抗体所识别的毒素A和B羧基端抗原区段。结论获得毒素A和B羧基端抗原区段具有很好的抗原活性,为进一步制备相应抗体并建立艰难梭菌毒素A和B的免疫检测方法奠定了基础。; 黄忱杨锡琴修冰水罗芸刘志强张旭辉赵琰枫金大智冯晓燕张贺秋; 关键词：艰难梭菌细菌毒素类原核表达

基于新型淬灭剂建立荧光PCR甄别幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因突变的方法被引量：3: 2016年; 目的采用新型淬灭剂结合荧光PCR检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因突变的检测方法。方法根据幽门螺杆菌23S r DNA第2142和2143两个基因多态性位点设计引物和标记新型荧光淬灭剂的探针;提取幽门螺杆菌菌体总DNA,采用实时荧光定量PCR方法对收集的55株幽门螺杆菌临床分离株进行检测,同时与Taq Man探针和直接测序方法结果进行比对,进一步评价其临床实用性。结果本试验建立的方法能特异性地甄别23S r DNA第2142和2143位点的基因多态性,除对应位点的探针出现荧光信号外,其他探针均为阴性。该方法的变异系数小于5%,样本灵敏度可达到1 copy/反应。对收集的55株幽门螺杆菌临床分离株进行检测,检测到AA型菌株36株(65.45%)、AG型菌株15株(27.27%)和GA型菌株4株(7.27%),与Taq Man探针及直接测序结果均一致。结论本试验所建立的方法能有效甄别幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因突变位点A2142G和A2143G。; 陈志勇罗芸黄忱叶菊莲应晟李辉金大智; 关键词：幽门螺杆菌荧光PCR

两种产毒型艰难梭菌分子诊断方法的临床应用评价被引量：1: 2018年; 目的通过与Xpert C．difficile/Epi检测临床粪便样本中艰难梭菌毒素基因方法的对比，系统评价实验室研发的艰难梭菌毒素基因多重荧光PCR检测方法的性能。方法2016年8月1日至12月30日采集杭州市余杭区第一人民医院和宁波市鄞州人民医院临床腹泻患者粪便样本176份，平行采用Xpert C．difficile/Epi和实验室研发的检测方法进行检测，同时进行艰难梭菌分离培养和PCR毒素鉴定。采用SPSS 20.0软件对检测结果进行交叉表分析。结果以Xpert C．difficile/Epi检测结果为标准，本实验室研发方法的敏感度为91.7%（22/24）、特异度为100%（152/152）、阳性预测值为100%（22/22）、阴性预测值为98.7%（152/154），两种方法检测结果的一致性好（Kappa＝0.950，P〈0.001）。以厌氧分离培养和PCR毒素检测结果为标准，本实验室研发方法的敏感度为90.0%（18/20）、特异度为97.0%（152/156）、阳性预测值为81.8%（18/22）、阴性预测值为98.7%（152/154）（Kappa＝0.838，P〈0.001）；Xpert C．difficile/Epi的敏感度为90.0%（18/20）、特异度为96.0%（150/156）、阳性预测值为75.0%（18/24）、阴性预测值为98.7%（150/152）（Kappa＝0.792，P〈0.001）。结论实验室研发的艰难梭菌毒素基因多重荧光PCR检测方法与Xpert C．difficile/Epi检测性能基本一致，可直接用于临床腹泻标本中产毒型艰难梭菌检测。该方法的临床应用为国内临床艰难梭菌感染病例的诊断提供一种国产化的检测方法。; 庄国华宋小军许星星罗芸黄忱叶菊连蔡剑王丽倩许向军王贤军汪一萍金大智; 关键词：艰难梭菌分子诊断

艰难梭菌毒素C蛋白的克隆表达和抗体制备: 2017年; 目的克隆艰难梭菌毒素C(tcdC)基因并构建TcdC蛋白的原核表达载体,制备多克隆抗体。方法从艰难梭菌标准株(ATCC43255)基因组DNA中扩增获得tcdC基因的部分片段,连接到原核表达载体并转化到大肠杆菌中,诱导表达GST-TcdC/L和IL1-TcdC/L融合蛋白,前者用作免疫抗原,后者用作检测抗原。采用SDS-PAGE法鉴定融合蛋白的表达,并通过Ni柱纯化IL1-TcdC/L融合蛋白,Q柱纯化GST-TcdC/L融合蛋白。将纯化的GST-TcdC/L融合蛋白于兔背部皮内多点注射,每只1 mg,4周1次,共3次。最后1次免疫后2周,采血分离血清。用IL1-TcdC/L蛋白包被酶联板,采用ELISA法检测多抗血清效价;Western蛋白印迹法检测多抗特异性,结果 SDS-PAGE结果表明,所表达的2个融合蛋白与预期分子质量一致。ELISA结果显示,制备的TcdC多克隆抗体效价>1:6.4×10~4。Western蛋白印迹实验显示,制备的TcdC/L多克隆抗体能特异性识别艰难梭菌中的TcdC蛋白。结论成功克隆了艰难梭菌tcdC/L基因并进行了原核表达,成功制备了其多克隆抗体,为后续研究tcdC基因在艰难梭菌致病过程中的作用及机制奠定了基础。; 王建霞王宏伟杨锡琴黄忱罗芸金大智冯晓燕张贺秋; 关键词：艰难梭菌多克隆抗体

艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的表达及抗原性分析被引量：1: 2016年; 目的构建艰难梭菌(CD)谷氨酸脱氢酶(GDH)的原核表达载体,表达重组蛋白并鉴定其抗原活性。方法以CD的ATCC43255菌株基因组DNA为模板,通过PCR法扩增GDH全长基因片段,构建原核表达载体并转化到大肠杆菌中,IPTG诱导表达GDH蛋白,并用Ni柱进行纯化。利用CD抗原检测试剂盒对GDH抗原区段的抗原性进行鉴定。结果构建的原核表达载体p ET-28a/GDH可在大肠杆菌中成功表达,获得的GDH抗原能与相应抗体产生特异性反应。结论原核表达的CD的GDH抗原具有很好的抗原活性,为进一步制备相应抗体并建立CD的GDH抗原的免疫检测方法奠定了基础。; 王建霞杨锡琴金大智黄忱罗芸宋晓国王宏伟冯晓燕张贺秋; 关键词：艰难梭菌谷氨酸脱氢酶原核表达

艰难梭菌分子分型技术研究进展被引量：1: 2016年; 艰难梭菌是一种革兰阳性的专性厌氧产芽孢杆菌。核糖体027型高毒力株在发达国家的多次暴发使得艰难梭菌越来越引起重视,近年来艰难梭菌感染的发生频率已在全世界范围内呈显著上升趋势。目前该菌的分子流行病学研究进展较快,常用的分子分型方法包括限制性酶切分型、PCR核糖体分型、脉冲场凝胶电泳、多位点序列分析、重复序列PCR分型、多位点可变数目串联重复序列分析、毒素分型和全基因组测序分析等。同时,仍有不断改进的新型分子分型方法应用于此,以期更准确、快速和有效地对艰难梭菌感染暴发进行识别与调查,为艰难梭菌的感染防控提供可靠的分子流行病学数据。; 黄忱罗芸王贤军金大智; 关键词：艰难梭菌分子分型分子流行病学

杭州市富阳区住院腹泻患者艰难梭菌感染及菌株分子特征分析被引量：6: 2019年; 目的了解浙江省杭州市富阳地区住院腹泻患者艰难梭菌感染情况,研究感染患者临床危险因素及分离菌株的分子特征。方法收集2017年5月至2018年2月就诊于第一人民医院的228例腹泻患者的粪便标本,通过厌氧培养进行艰难梭菌菌株分离和鉴定,进行多位点序列基因分型,以琼脂稀释法测定菌株耐药性,对患者临床资料进行统计分析。结果 228份标本共检测出产毒型艰难梭菌41株,其中31株为医院获得性腹泻;阳性患者平均年龄67.8岁,主要来自消化内科(34.1%)和肾内科(19.5%)。ST2、ST3和ST54为主要基因型。所有菌株对万古霉素、甲硝唑、四环素、哌拉西林敏感。临床资料统计分析显示,>60周岁、患基础性疾病和有抗生素用药史的阳性患者数量远高于阴性患者比例(χ2=4.229、9.022、5.767,P=0.023、0.001、0.009)。结论杭州市富阳区住院腹泻患者艰难梭菌感染患者主要来源于院内感染。患有基础性疾病、8周内有抗生素用药史的老年患者为感染的危险因素;在院内感染防控中需进一步加强监测。; 黄有平金旭华叶菊连罗芸李珺宋小军黄忱金大智; 关键词：艰难梭菌腹泻分子特征

一种艰难梭菌毒素基因检测方法的临床应用评价被引量：7: 2017年; 目的通过与BD MAX试剂盒检测临床粪便标本中艰难梭菌毒素基因的比对,评价本实验室前期研发的艰难梭菌毒素基因检测方法.方法本研究为临床应用研究.2014年7月1日至9月30日采集浙江中医药大学附属杭州市第一医院的腹泻患者粪便标本147份,分别采用BD MAX和本实验室前期研发的艰难梭菌毒素基因检测方法进行检测.BD MAX试剂盒采用自动化核酸提取和PCR检测;实验室前期研发方法通过提取粪便DNA后进行荧光定量PCR检测,最后采用SPSS10.0软件进行分析.结果 147份标本中,两方法均检出艰难梭菌毒素B基因阳性33份,阴性114份,其中有4份标本的结果不一致.以BD MAX试剂盒的结果为标准,得出本实验室前期研发的艰难梭菌毒素基因检测方法的敏感度为93.94%（31/33）,特异度为98.25%（112/114）,阳性预测值为93.94 %（31/33）和阴性预测值为98.25 %（112/114）.且上述两种方法检测结果的一致性较好（Kappa值为0.922,P〈0.01）.结论本实验室前期研发的艰难梭菌毒素基因检测方法与BD MAX试剂盒性能相似,敏感度高、特异度强,同时该方法成本低并可直接对腹泻标本进行测定,无需配套提取仪器,更适合我国临床开展常规艰难梭菌毒素基因检测.; 王丽倩罗芸黄忱叶菊莲宋小军金大智王贤军; 关键词：难辨梭菌细菌毒素类分子诊断技术

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黄忱

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