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抑制人BI-1基因表达shRNA重组慢病毒表达载体的构建(英文)被引量：1: 2009年; 背景:慢病毒介导的RNAi技术以其专一性、抑制效率高、作用持久等优点已广泛应用于基因功能研究中。该技术病毒包装、转染、以及shRNA序列设计都会对抑制效率产生影响。因此实验以人的Bax抑制子1(BI-1)为目的基因进行RNA干扰实验来探讨其影响因素。目的:为了利用慢病毒Lentivirus介导的RNAi技术寻找抑制人BI-1基因表达的siRNA。设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-09/2008-12在北京大学医学部基础医学院医学遗传学系完成。材料:293T细胞、SH-SY5Y细胞为实验室保存;用Ambion公司(www.ambion.com)提供的网络在线工具设计了4个shRNA。方法:构建带有绿色荧光蛋白(EGFP)标签的、针对人BI-1基因不同区域设计的shRNA重组表达载体,然后与包装蛋白表达载体共转染293T细胞以包装成4种shRNA病毒粒子。通过流式细胞仪检测GFP的表达情况来摸索最佳包装条件。Real-timePCR以β-肌动蛋白mRNA被用作内参,将4种重组病毒和对照组病毒上清液侵染SH-SY5Y,检测内源性BI-1基因的敲低效率,筛选到最佳RNAi有效序列。主要观察指标:被不同包装病毒侵染的细胞内GFP的表达率。结果:pLentiLox3.7、rev、vsvg、rre等4质粒包装系统的最佳包装比例为2:1:1:1,包装48h收获的病毒粒子的感染效率最高,并且在包装后的24h之后换液会提高包装效率。靶定到人BI-1基因-2-17核苷酸(起始编码区域)的shRNARNA干扰效率最高。能够抑制40%正常基因表达。结论:实验摸索出Lentivirus介导的RNAi技术病毒包装的重要影响因素。为建立稳定的人BI-1基因表达敲低的神经细胞模型和研究BI-1异常表达参与的神经元凋亡疾病的病理研究打下基础。; 吴丹王师尧王佩蓉金巍娜; 关键词：RNA干扰

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王佩蓉

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