周健华
- 作品数：3 被引量：5H指数：2
- 供职机构：吉林大学人兽共患病研究所人兽共患病教育部重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学更多>>
- 恶性疟原虫PfRNase Ⅱ的克隆表达与降解特性的初步分析被引量：3
- 2016年
- 目的利用原核表达系统诱导表达恶性疟原虫融合蛋白pGEX-PfRNaseⅡ,并分析其RNA降解特性。方法分析并选取恶性疟原虫3D7株PfRNaseⅡ的活性区,以cDNA为模板PCR扩增目的片段。将目的片段插入到pGEX-4T-1表达载体中,构建pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ重组表达质粒,转化至大肠埃希菌BL21-CodonPlus(DE3),利用IPTG诱导表达目的蛋白pGEX-PfRNaseⅡ。应用Glutathione-SepharoseTM 4B树脂纯化目的蛋白。并用pGEX-PfRNaseⅡ体外分析PfRNaseⅡ的RNA降解特性。结果经PCR、双酶切、测序鉴定,pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ重组表达质粒构建正确,转化DE3后在IPTG的作用下表达目的蛋白。纯化的目的蛋白pGEX-PfRNaseⅡ在体外可降解单链RNA,但不能降解双链RNA。pGEX-PfRNaseⅡ在低浓度的Mg2+条件下降解活性较强,高浓度Mg2+条件下活性受到抑制,在5mmol/L EDTA存在下活性降低。结论克隆表达的pGEX-PfRNaseⅡ重组蛋白能水解单链RNA,且该水解活性具有二价金属离子依赖性。
- 余胜超常志广土志伟黄朋韩悦赵帅杰魏晓艳周健华陆慧君姜宁陈启军
- 关键词：原核表达RNA降解
- 恶性疟原虫裂殖子新型蛋白质(PF3D7_0811600)的表达纯化及其多克隆抗体的制备被引量：2
- 2016年
- 利用大肠杆菌原核表达并纯化恶性疟原虫3D7株裂殖子新型蛋白质PF3D7_0811600,免疫家兔制备特异性多克隆抗体,通过对虫体天然蛋白的识别,分析PF3D7_0811600在虫体内的表达。采用PCR技术从恶性疟原虫3D7株总DNA中获得PF3D7_0811600基因的目的片段,连接到p MD18-T克隆载体,得到的克隆质粒经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,构建重组原核表达质粒p ET-PF3D7_0811600和p GEX-PF3D7_0811600,通过优化表达条件,分别在大肠杆菌中得到高效表达,并用亲和层析柱纯化目的蛋白质。用纯化的His标签重组蛋白质免疫家兔,用Western Blot方法检测制备的特异性多克隆抗体。结果表明:成功纯化并获得重组蛋白质,用间接ELISA方法检测多抗效价达到1∶16 000,用Western Blot检测结果表明制备的多克隆抗体具有良好的特异性,能够识别虫体天然蛋白。恶性疟原虫3D7株裂殖子新型蛋白质PF3D7_0811600在虫体晚期表达,说明该蛋白在虫体发育的晚期发挥重要作用,猜测其可能与裂殖子入侵宿主红细胞有关。
- 周健华魏晓燕常志广姜宁陆慧君陈启军
- 关键词：恶性疟原虫裂殖子原核表达多克隆抗体
- 恶性疟原虫3D7株新型裂殖子蛋白质(PF3D7_1361800)的表达纯化及多克隆抗体的制备被引量：2
- 2015年
- 目的用大肠埃希菌表达PF3D7_1361800蛋白,制备多克隆抗体。方法根据PF3D7_1361800蛋白的水溶性分析,设计目的基因引物,采用PCR技术扩增目的基因片段,长度为897bp。将其克隆到pMD18-T载体,测序正确后将该片段连接到pET-28a和pGEX-4T-1表达载体中,测序鉴定正确后将重组质粒转化到大肠埃希菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL中,用0.1mmol/L IPTG诱导表达,用His GraviTrapTM和Gluthathione-Sepharose 4B亲和层析柱纯化目的蛋白质。用His-tag重组蛋白免疫家兔,每2周免疫一次,分别于免疫后14、28、42、52d采血,用间接ELISA法测定抗体效价。以制备的多克隆抗体作为一抗,采用Western blot分析其特异性。结果经测序和酶切鉴定,成功构建了表达载体pET-PF3D7_1361800和pGEX-PF3D7_1361800。SDS-PAGE分析亲和纯化的重组蛋白纯度较好,间接ELISA法检测该蛋白免疫兔血清抗体效价>1∶16 000。结论成功克隆了PF3D7_1361800的表达载体并表达目的蛋白,制备的抗重组蛋白多克隆抗体具有特异性,为研究该蛋白质的生物学功能及疟疾疫苗的研发奠定了基础。
- 魏晓艳姜宁周健华常志广赵欣土志伟余胜超韩悦黄朋赵帅杰陆慧君陈启军
- 关键词：裂殖子原核表达多克隆抗体
