陈丽丽
- 作品数：4 被引量：3H指数：1
- 供职机构：南方医科大学南方医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 改变PTEN基因表达影响支气管平滑肌细胞增殖被引量：1
- 2010年
- 目的:通过基因过表达和RNA干扰(RNAi)技术改变PTEN基因的表达并观察其对人支气管平滑肌细胞(BSMC)增殖和相关信号通路的影响。方法:利用携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-GFP-PTEN)和针对PTEN基因的腺病毒短发夹状RNA(shRNA)载体(Ad-GFP-shRNA-PTEN),转染BSMC细胞,建立PTEN基因过表达细胞模型Ad-GFP-PTEN-BSMC和PTEN基因沉默细胞模型Ad-GFP-shPTEN-BSMC,并以感染Ad-GFP和空白组作为对照。通过荧光倒置显微镜检测转染效率;Westernblot法检测PTEN蛋白的表达和AKT、ERK1/2通路的活化情况;MTS/PMS法检测细胞生长的变化;PI单染流式细胞术检测细胞周期的变化。结果:腺病毒介导的过表达载体和shRNA载体都能有效改变PTEN基因的表达。PTEN基因表达上调后,BSMC细胞生长受到抑制,G0-G1期细胞增多,S期细胞和G2/M期细胞减少,PI3K/AKT通路受到抑制,而MAPK/ERK通路未见变化;PTEN基因表达下调后,BSMC细胞生长受到促进,S期细胞增多,G0-G1期细胞和G2/M期细胞减少,PI3K/AKT通路激活,但MAPK/ERK通路却受到抑制。结论:PTEN基因可能主要通过调节PI3K/AKT通路影响人支气管平滑肌细胞的生长。
- 张达成罗雅玲赖文岩钟浩海陈丽丽
- 关键词：腺病毒载体细胞增殖AKTERK1/2
- PTEN重组腺病毒载体的构建及其在气道平滑肌细胞的表达被引量：1
- 2009年
- 目的应用pAdxsi载体系统构建携带PTEN基因的腺病毒载体。方法将PTENcDNA自载体pcDNA3-PTEN中切出,克隆至穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV中,然后与腺病毒质粒pAdxsi在化学感受态细胞DH5α菌株内同源重组,经Pac-Ⅰ线性化后,重组子通过脂质体2000介导转染HEK293细胞,产生有感染能力的腺病毒,并测定其滴度,通过荧光显微镜能观察HEK293细胞内绿色荧光的表达;PCR检测腺病毒载体PTEN mRNA的表达,Western blotting检测PTEN蛋白在气道平滑肌细胞的表达。结果感染腺病毒载体的HEK293细胞表达GFP随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应,经过3轮扩增后病毒达到合适的滴度,构建的Ad-PTEN腺病毒滴度为2×1010pfu/ml,PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳证实其表达,Western blotting检测到腺病毒感染的气道平滑肌细胞内PTEN蛋白表达明显增高。结论成功构建了携带野生型PTEN腺病毒载体,为进一步研究PTEN基因应用于哮喘治疗提供了实验基础。
- 钟浩海罗雅玲赖文岩徐健陈丽丽叶涵
- 关键词：PTEN腺病毒载体气道平滑肌细胞哮喘
- PTEN基因重组腺病毒对人气道平滑肌细胞增殖的影响及其作用机制
- 2009年
- 目的观察携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-PTEN)体外转染人气道平滑肌细胞(HASMC)后的表达,研究其对HASMC增殖的影响,并对其作用机制作初步的探讨。方法利用pAdxsi载体系统构建携带PTEN基因的腺病毒载体,体外转染HASMC,荧光显微镜观察Ad-PTEN的转染效率。RT-PCR及Western blotting检测PTEN在HASMC中的表达。采用MTS/PMS法检测细胞增殖,流式细胞仪测定细胞周期分布。Western blotting检测Akt及p-Akt的表达,RT-PCR检测P21mRNA的表达。结果外源性野生型PTEN基因经腺病毒介导成功转入HASMC,当感染复数MOI为100时,体外转染效率高达98%以上。Ad-PTEN感染HASMC后,能有效地引起细胞内过度表达PTEN。上调PTEN表达能显著提高G0/G1期细胞的比例,抑制细胞的增殖。上调PTEN表达能显著降低p-Akt及提高P21的表达水平。结论成功构建了过度表达PTEN的原代培养HASMC模型,该模型能有效地引起细胞内过度表达PTEN。上调PTEN表达能有效抑制HASMC的增殖,可能是通过对PI3K/AKt信号通路的抑制及上调P21的表达而起作用的。
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- 关键词：气道平滑肌细胞PTENAKT
- 抑癌基因PTEN shRNA腺病毒载体的构建被引量：1
- 2009年
- 目的:构建抑癌基因PTENshRNA腺病毒载体,探讨PTEN在哮喘患者气道重塑的作用机制。方法:设计形成短发夹序列(shRNA)的PTEN-shRNA引物对应的模板DNA序列,亚克隆至pShuttle-GFP-U6重组穿梭载体,构建穿梭质粒pShuttle-GFP-U6-PTEN-shRNA。鉴定正确后,然后与腺病毒质粒pAdxsi在化学感受态细胞DH5α菌株内同源重组,得到pAdxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA病毒质粒,将pAdxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA质粒经PacI线性化后转染HEK293细胞,包装重组、并大量扩增pAdxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA腺病毒质粒,氯化铯梯度离心纯化,测病毒滴度,Western blot检测PTEN蛋白水平的表达。结果:结果证实pShuttle-GFP-U6-PTEN-shRNA及pAdxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA质粒构建正确,收获病毒后的PCR及Western blot检测结果均证明pAdxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA包被成功。结论:抑癌基因PTENshRNA腺病毒载体成功构建,为进一步研究PTEN基因应用于哮喘治疗提供了相关的实验基础。
- 钟浩海罗雅玲赖文岩陈丽丽张达成
- 关键词：PTEN腺病毒载体气道平滑肌细胞
