李志伟
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
- 供职机构：昆明医学院第二附属医院更多>>
- 发文基金：云南省应用基础研究基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 流式细胞术辅助筛选和纯化人缺氧诱导因子-1α基因沉默肝癌细胞株
- 2011年
- 目的利用流式细胞术(FCM)协助筛选、纯化RNA干扰(RNAi)效率高的人缺氧诱导因子1-α(HIF-1α)基因沉默肝癌细胞株.方法选择带Neor及GFP基因的质粒pGenesil-1.1构建HIF-1α靶向小干扰RNA(siRNA)重组表达载体,转染人肝癌细胞株SMMC7721.首先用G418筛选,然后用FCM检测出常氧、缺氧条件下HIF-1α蛋白表达抑制效率最高的转基因细胞株.根据FCM可分选GFP阳性细胞这一特点,进一步用流式细胞分选仪分选纯化转基因细胞,最后用PCR和免疫组化方法鉴定纯化细胞株的HIF-1α干扰效率.结果单用G418筛选HIF-1α干扰组细胞最高筛选效率为32.9%,FCM检测HIF-1α蛋白抑制率为78.7%～92.8%;合并使用G418和FCM分选纯化后,最佳HIF-1α干扰组筛选效率达94.4%,常氧、缺氧条件下对HIF-1αmRNA表达抑制率分别为95.5%、85.2%.结论合并使用G418及FCM分选纯化得到了高RNAi效率的人HIF-1α基因沉默肝癌细胞株,为进一步研究HIF-1α与肝癌关系及靶向HIF-1α的肝癌基因治疗提供了实验基础.
- 王燕李志伟楚青江萍危群陆晓青
- 关键词：RNA干扰流式细胞术
- 低氧诱导对人肝癌SMMC7721细胞生物学行为的影响被引量：1
- 2011年
- 目的研究低氧对体外培养的人肝癌细胞株SMMC7721增殖、细胞周期、凋亡和黏附、迁移能力的影响,探讨其中可能存在的分子机制.方法通过氯化钴诱导人肝癌SMMC7721细胞低氧,MTT法、流式细胞术、细胞黏附试验、transwell小室迁移实验观察低氧对肝癌细胞增殖、凋亡和细胞周期以及细胞黏附和迁移能力的影响;采用RT-PCR和免疫细胞化学方法检测低氧对细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶2(MMP2)mRNA和蛋白表达的影响.结果 MTT法显示氯化钴诱导的低氧对肝癌细胞生长起抑制作用;低氧24 h,流式细胞术显示细胞凋亡、坏死增加,细胞周期G0/G1期、S期细胞比例减少,G2/M期比例增加;黏附试验显示低氧后细胞黏附力增强(P<0.01),transwell小室实验显示,低氧后细胞迁移能力较常氧时明显增加(P<0.05);RT-PCR和细胞免疫化学检测显示低氧条件下HIF-1α、VEGF、MMP2的mRNA和蛋白表达均较常氧时增加(P<0.05).结论氯化钴诱导低氧可抑制SMMC7721细胞增殖,使细胞周期阻滞于G2/M期,细胞凋亡、坏死增加,同时细胞黏附、迁移能力增强;低氧时HIF-1αmRNA和蛋白表达增加,并通过调节及其下游靶基因VEGF、MMP2的表达参与了这一生物学行为的转变.
- 王燕李志伟江萍危群易晓佳陆晓青
- 关键词：肝癌细胞缺氧细胞周期缺氧诱导因子1-Α
