李东亮
- 作品数：10 被引量：12H指数：2
- 供职机构：滨州医学院口腔医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金山东省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- Smad3调控成釉细胞Amelotin启动子转录活性的研究被引量：1
- 2015年
- 目的:研究Smad3对Amelotin启动子转录活性的影响。方法:用基因克隆技术获得含有不同长度Amelotin启动子片段的荧光素酶报告基因载体,然后将其与Smad3瞬时转染小鼠成釉细胞,并用双荧光素酶报告基因检测其活性;生物学信息软件对人和小鼠的Amelotin基因启动子序列的同源性进行BLAST分析;凝胶迁移实验(EMSA)观察Smad3和Amelotin启动子特异性结合位点之间的相互作用;基因定点突变构建Smad3结合位点突变型Amelotin启动子,并用双荧光素酶报告基因检测系统分析Smad3对野生型和突变型Amelotin启动子转录活性的影响。结果:Smad3转染后,Amelotin启动子(-160^+196)转录活性明显增强(P<0.05);将人与小鼠的Amelotin启动子序列(-160^+196)进行Blast序列比对,发现两序列在(-160^-1)具有很大的同源性;EMSA结果显示,Smad3与Amelotin启动子(-160^+196)的GTCTG有相互作用;将Amelotin启动子上Smad3结合位点特征性序列"GTCTG"突变为"CCCTG"后,Smad3对突变型Amelotin基因启动子的转录活性无显著影响(P>0.05)。结论:转录因子Smad3可通过与Amelotin启动子特定序列结合而调控Amelotin的基因表达,从而在釉质发育过程中发挥重要作用。
- 许针针张莉王玉敏李东亮高艳高玉光
- 关键词：SMAD3EMSA
- 整合素β1调控成釉细胞外基质蛋白表达的研究
- 2013年
- 目的:观察整合素β1(Integrinβ1)在小鼠牙胚成釉细胞中的表达及其对成釉细胞细胞外基质蛋白——釉原蛋白(Amelogenin,AMELX)、成釉蛋白(Ameloblastin,AMBN)、釉成熟蛋白(Amelotin,AMTN)mRNA表达的影响。方法:采用免疫组化方法检测整合素β1在小鼠牙胚成釉细胞中的表达。构建真核重组表达载体pcDNA3.1/myc-hisA-Integrinβ1,并将其转染至小鼠成釉细胞,利用实时定量Real-time PCR法检测AMELX、AMBN、AMTN mRNA表达水平。结果:整合素β1在小鼠牙胚发育各期成釉细胞中均有表达。RT-PCR检测显示,与转染空白质粒的对照组相比,转染pcDNA3.1/myc-hisA-Integrinβ1的成釉细胞中AMELXmRNA的表达水平明显上调(P<0.05),但对AMBN和AMTN mRNA表达无显著促进作用(P>0.05)。结论:整合素β1在小鼠牙胚成釉细胞中表达,并促进Amelogenin在成釉细胞中的表达,提示整合素β1通过调节釉原蛋白而影响牙齿的发育和矿化。
- 张海英邵丹李伯翰韩婷婷李东亮王玉敏孙岩张娟娟高玉光
- 关键词：整合素Β1成釉细胞
- 釉成熟蛋白Amelotin抗体的制备和初步鉴定被引量：7
- 2009年
- 目的:表达并纯化小鼠釉成熟蛋白(Amelotin),制备多克隆抗体,并进行初步鉴定。方法:RT-PCR获得Amelo-tin成熟肽片段,构建pET32a-Amelotin,IPTG诱导表达Amelo-tin,纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗体滴度。Western blot和免疫组织化学鉴定抗体特异性。结果:成功构建了Amelotin重组表达载体pET32a-Amelotin,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可以达到1∶12800。Western blot分析表明该抗体能特异结合Amelotin,免疫组化分析表明自制的抗体能特异的与Amelotin相互作用。结论:以纯化的Amelo-tin为免疫原,成功地制备了效价及特异性较高的兔抗Amelo-tin抗体,为进一步建立简便的Amelotin检测方法及研究Amelotin生物学功能奠定了良好的基础。
- 孙岩张娟娟韩婷婷李东亮曹雪梅李武修高玉光
- 关键词：原核表达多克隆抗体
- 强力霉素调控的真核表达体系ALC-pTet-on Advanced成釉细胞株的建立
- 2010年
- 目的:建立可受强力霉素调控的高表达外源基因的真核表达体系ALC-pTet-on Advanced细胞株,用于基因功能的研究。方法:将质粒pTet-on Advanced转染至成釉细胞系(ALC),用1 000μg/mL的G418筛选抗性克隆。用RT-PCR进行DNA的整合鉴定,并瞬时转染荧光素报告基因(pTRE-Tight-Luc)对pTet-on Advanced阳性克隆株的功能进行鉴定。结果:G418压力筛选后,获得了13个细胞克隆株,RT-PCR检测均表达反义四环素转录激活子(rtTA Advanced),PCR产物测序结果与pTet-on Advanced基因序列一致,表明pTet-on Advanced基因片段已整合进小鼠成釉细胞基因组DNA,荧光素报告基因功能鉴定获得l株诱导表达倍率为22.1的克隆株,且pTet-on Advanced基因阳性的成釉细胞株的形态和生长度与正常成釉细胞没有明显差异。结论:通过脂质体转染的方法成功地获得l株诱导表达倍率为22.1的高表达成釉细胞株,为进一步研究EMPs在成釉细胞中功能打下了基础。
- 李东亮梁广智何永云刘晓影孙岩张娟娟李武修高玉光
- 关键词：转染
- 釉成熟蛋白和釉原蛋白基因在小鼠牙胚发育过程中的时空表达研究被引量：6
- 2009年
- 目的：观察、比较小鼠釉成熟蛋白（amelotin）和釉原蛋白（amelogenin）基因在牙齿发育过程中的表达。方法：利用Digoxigenin标记的cRNA探针，采用原位杂交技术对amelotin和amelogenin基因表达进行组织学定位；然后从小鼠下颌中提取总RNA，采用RT—PCR技术观察小鼠amelotin和amelogenin基因在小鼠下颌组织中的表达。结果：在出生后1d的小鼠下颌第一磨牙，随着前期牙本质形成，amelogenin在成釉细胞层开始表达，并逐渐增强，但未检测到amelotin基因表达；在出生后5d的小鼠，成釉细胞处于分泌期，amelotin和amelogenin基因在成釉细胞中显著表达；在出生后10d小鼠下颌第一磨牙，amelotin和amelogenin基因在牙尖周围成熟期成釉细胞中的表达信号明显降低。利用RT—PCR技术，在新生小鼠下颌中未检测到amelotin基因表达，但amelogenin已开始表达；从出生1—7d小鼠下颌中均检测到amelotin和amelogenin基因表达；在出生后7d小鼠，amelogenin表达显著下降。结论：amelotin和amelogenin均参与了釉质发育过程；amelotin基因表达迟于amelogenin基因，提示两种釉质基质蛋白在釉质发育过程中可能发挥不同生物学作用。
- 魏亚红孙岩张娟娟李东亮韩婷婷高玉光
- 关键词：釉原蛋白成釉细胞原位杂交
- Tet-on Advanced调控Amelotin基因表达成釉细胞系的建立
- 2009年
- 目的应用Tet-on Advanced基因表达系统构建由强力霉素(Dox)诱导Amelotin基因表达的成釉细胞系,为进一步研究Amelotin基因的生物学功能奠定基础。方法通过RT-PCT法从出生后7d的小鼠牙胚中克隆得到Amelotin的全长基因,测序正确后将其亚克隆入pTRE-Tight载体中,利用Tet-on Advanced基因表达系统先后将调控质粒pTet-on Advanced和反应质粒pTRE-Tight-Amelotin转入成釉细胞,分别用G418和潮霉素进行筛选,克隆扩增得到可诱导表达Amelotin基因的成釉细胞系。用RT-PCR法检测不同Dox浓度下转染成釉细胞中Amelotin基因的表达。结果连续两个回合的转染及筛选后获得了引入pTet-on Advanced系统的细胞系,能够高诱导低背景表达Amelotin,在强力霉素诱导48h可以使Amelotin的表达显著增加,强力霉素在一定浓度范围内可以诱导Amelotin的表达呈剂量依赖性增加。结论成功构建了受强力霉素调控的双重稳定表达Amelotin成釉细胞系,为进一步研究Amelotin与釉质矿化之间的关系奠定了基础。
- 李东亮郝建忠孙岩李武修高玉光
- 关键词：TET-ONADVANCEDRT-PCR
- 釉成熟蛋白amelotin在大肠杆菌中的表达和纯化被引量：1
- 2009年
- 目的:观察釉成熟蛋白(amelotin)基因聚合酶链反应产物在大肠杆菌中的表达,并获得纯化的釉成熟蛋白。方法:利用His融合蛋白表达载体pET32a(+)转化大肠杆菌BL21,通过异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,并改变诱导时间、温度、IPTG浓度来优化表达条件,然后在优化的条件下进行大量表达并收菌;His镍柱纯化表达的蛋白。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白表达、纯化情况。结果:电泳结果分析表明:amelotin PCR扩增产物在大肠杆菌中获得高效表达,大小约4×104,纯化得到的amelotin纯度较高。结论:成功得到纯化的amelotin,为进一步制备抗体奠定基础。
- 孙岩林婷婷张娟娟曹雪梅韩婷婷李东亮李武修高玉光
- 关键词：小鼠大肠杆菌纯化
- MEF2C调控成釉细胞MMP-20基因启动子转录活性的研究被引量：1
- 2013年
- 目的:通过研究MEF2C转录因子对小鼠成釉细胞金属基质蛋白酶-20(matrix metalloprotei-nase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,明确MEF2C的功能,为研究MEF2C在釉质形成中的作用奠定基础。方法:用RT-PCR的方法扩增小鼠MEF2C基因,并构建真核表达载体pcDNA3.1/myc-hisA-MEF2C;对MMP-20基因启动子区域(-1197～+23)中MEF2C潜在的结合位点进行定点突变,并构建至荧光报告载体pGL3-Basic中;利用双荧光素酶基因报告系统分析MEF2C对MMP-20基因启动子转录活性的影响。结果:在成釉细胞中过量表达MEF2C能够明显提高MMP-20基因启动子的转录活性,而对定点突变后的MMP-20基因启动子转录调控作用减弱。结论:小鼠成釉细胞核中MEF2C可通过MMP-20启动子上MEF2C潜在的结合位点,上调MMP-20基因表达水平。
- 刘珩李伯翰韩婷婷李东亮王玉敏孙岩曲政高玉光
- 关键词：成釉细胞定点突变
- 转录因子Ets-2调控小鼠成釉细胞MMP-20基因表达的研究被引量：1
- 2013年
- 目的:通过研究Ets-2转录因子对调控小鼠成釉细胞金属基质蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确Ets-2在釉质发育中的作用。方法:应用免疫组化方法观察出生后5d小鼠切牙成釉细胞中Ets-2的表达;在小鼠成釉细胞中分别转染200ng pcDNA3.1/myc-HisA-Ets-2和Ets-2siRNA后,利用实时定量RT-PCR法检测MMP20基因表达的不同变化;用双荧光素酶报告基因检测系统分析Ets-2对MMP-20启动子突变后转录活性的影响。结果:免疫组化显示Ets-2在成釉细胞中呈阳性表达。实时定量RT-PCR研究发现Ets-2过表达后,MMP-20表达水平显著增加;当Ets-2基因沉默后,MMP-20表达水平则显著下降。双荧光素酶报告基因检测系统检测显示,转染pcDNA3.1/myc-HisA-Ets-2的实验组与对照组相比,MMP-20启动子的转录活性升高;对启动子Ets潜在结合部位进行定点突变后,MMP-20启动子的转录活性显著下降,Ets-2丧失上调MMP-20启动子转录活性的作用。结论:小鼠成釉细胞核中Ets-2可通过MMP-20启动子上Ets潜在结合位点,上调MMP-20基因表达水平。
- 孙霞王青山韩婷婷李东亮孙学玲孙岩纪虹利高玉光
- 关键词：免疫组化RT-PCR
- EGF与TGF-β1调控MMP20基因表达的研究被引量：1
- 2013年
- 目的观察表皮生长因子(EGF)与TGF-β1对小鼠成釉细胞金属基质蛋白酶-20(MMP20)基因表达的调控作用,并探讨其分子作用机制。方法利用Real time-PCR法分析EGF,TGF-β1对成釉细胞MMP20基因表达的影响;阻断MAPK通路,利用Real time-PCR法分析EGF,TGF-β1对MMP20基因表达的影响;利用双荧光素酶基因报告系统分析EGF,TGF-β1对成釉细胞MMP20基因启动子转录活性的影响。结果与对照组相比,EGF与TGF-β1均显著上调MMP20基因表达;加入MAPK抑制剂后,显著抑制了EGF与TGF-β1对MMP20基因表达的作用。双荧光素酶报告基因检测系统显示:与对照组相比,EGF与TGF-β1显著促进MMP20基因启动子的转录活性。结论 EGF通过P38通路与ERK通路上调MMP20的表达;TGF-β1通过p38通路与JNK通路上调MMP20的表达。
- 于会杰王玉敏韩婷婷李东亮李伯翰张娟娟孙岩高玉光
- 关键词：EGFTGF-Β1P38MAPK
