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π-π作用诱导的胶原纳米纤维分级自组装: 2021年; 类胶原多肽(collagen-like peptides)具有来源清洁和可调控等优点,是研究胶原蛋白分子的理想模型.本研究将两个含有不同芳香环数量的有机小分子3,3′-二甲基-4,4′-联苯二异氰酸酯和1,4-苯二异氰酸酯修饰在类胶原多肽的氮端,形成杂合肽,利用有机小分子提供的π-π作用力促进其自组装,并研究芳香环数量对胶原三股螺旋进一步高聚的影响.通过原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)和透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)对高聚组装的类胶原杂合肽进行形貌表征.结果表明,经3,3′-二甲基-4,4′-联苯二异氰酸酯分子修饰的类胶原杂合肽可以高聚组装形成纳米纤维结构,其氮端含有两个芳香环,分子空间结构较大,可能实现三股螺旋交错堆叠组装,这为胶原纳米纤维分级自组装提供了一种新思路.; 闫皓洁郑虹宁许菲; 关键词：物理化学胶原蛋白自组装纳米纤维

结构指导的玉米赤霉烯酮水解酶的热稳定性改造被引量：2: 2023年; 玉米赤霉烯酮是世界上污染最为广泛的一种镰刀菌(Fusarium)毒素,严重危害牲畜以及人类的健康。来源于粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)的玉米赤霉烯酮水解酶(zearalenone hydrolase,ZHD)能有效降解饲料中的玉米赤霉烯酮,然而饲料加工中的高温环境限制了该酶的应用。基于结构特征的理性设计可为酶的热稳定性改造提供指导。本研究首先基于蛋白质结构比对(multiple structure alignment, MSTA)筛选ZHD的结构灵活区,随后基于序列保守性打分以及构象自由能计算设计突变文库,得到基于136号和220号残基的9个单点突变设计。结果表明,9个突变体的热熔融温度(Tm)提高了0.4–5.6℃,其中S220R和S220W热稳定性表现最好,Tm分别提高了5.6℃和4.0℃,45℃下的热半失活时间分别延长了15.4倍和3.1倍,相对酶活分别为野生型的70.6%和57.3%。分子动力学模拟分析表明突变位点及附近区域的作用力得到了增强,突变体S220R和S220W的220-K130氢键成键概率分别增加了37.1%和19.3%、K130-D223盐桥成键概率分别增加了30.1%和12.5%,为ZHD热稳定性的提高作出了贡献。这项工作表明结合天然酶的结构比对、序列分析及自由能计算的热稳定性改造策略的可行性,并获得了热稳定性增强的ZHD变体,为ZHD在工业上的应用打下基础。; 官嫒林张萌许菲; 关键词：热稳定性分子动力学模拟

基于胶原异三聚体的成骨不全症机理研究: 2023年; 胶原蛋白是细胞外基质的主要成分,由3条链缠绕构成三螺旋.在28种天然胶原中占比最大的是Ⅰ型胶原蛋白,它是由两条a1链与一条a2链构成的异三聚体,a1或a2链中甘氨酸单点突变会导致成骨不全症.基于更接近天然胶原的异三聚体模型(abc),3条链中分别引入Gly→Ala,构建7种突变体.差示扫描量热结果表明,单点突变体的熔融温度(Tm)值降低15℃,双点及三点突变体未形成三螺旋结构.利用梯阶模型分析分子动力学模拟轨迹,突变点附近梯阶参数值发生变化,表明三螺旋结构局部解折叠.引入弹性函数量化胶原结构变化程度,发现氢键能量与结构形变分数具有高关联性(R2=0.76),表明突变不仅破坏了氢键作用力,也导致了分子的弯曲与运动状态的变化.结合计算与实验,解析了甘氨酸突变对胶原整体结构与运动模式的影响,为进一步揭示甘氨酸突变的致病机理提供了理论基础.; 强书敏吕成许菲; 关键词：胶原蛋白成骨不全症

富脯氨酸胶原蛋白的重组表达及热稳定性研究: 2022年; 细菌胶原蛋白制备工艺简单、成本低,在食品、医药材料等领域有着广泛的应用前景,但细菌胶原蛋白的热稳定性低,限制了其应用。该文以截短的酿脓链球菌胶原蛋白Scl2序列为研究对象,通过嵌合富脯氨酸序列,构建了表达高热稳定性重组胶原蛋白的大肠杆菌基因工程菌,并对重组菌株的发酵条件进行优化。结果表明,在诱导菌体浓度为OD_(600)值为2.5,发酵时间为24 h、诱导剂终浓度为1.0 mmol/L、诱导温度为35℃时,富脯氨酸胶原蛋白产量最高。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和质谱鉴定,亲和纯化后获得高纯度胶原蛋白,圆二色谱实验证明所制备的胶原蛋白能正确折叠形成三股螺旋结构。在N端和C端同时嵌合富脯氨酸序列(Pro-Pro-Gly);的胶原蛋白的热稳定性提高最大,T;值与原始胶原蛋白Sp2B相比提高了23℃,为设计高热稳定性的重组胶原蛋白材料提供了基础。; 胡金远乔士达张萌许菲; 关键词：胶原蛋白异源表达发酵优化热稳定性

类胶原多肽-DNA共聚序列自组装制备类核蛋白纳米粒子: 2019年; 尽管目前已有大量对自组装及生物纳米材料研究的报道,但大多数关于自下而上自组装的纳米结构仅使用1种类型的结构单元,这限制了结构和功能的多样性.受到核酸与蛋白组装成核蛋白的启发,我们设计了DNA与多肽的共聚序列,利用这2类大分子自组装时天然存在的正交性,可构建更为复杂的超分子自组装体系.研究了炔丙基甘氨酸修饰的类胶原肽pra(POG)8通过一价铜离子催化的叠氮-炔基环加成(CuAAC)点击化学,分别成功地与2条碱基互补的DNA单链偶联,产生2种CMP-DNA共聚序列,并由变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化.这2种CMP-DNA共聚序列先分别在4℃静置,由圆二色谱表征确定(POG)8形成三股螺旋后1∶1等体积混合,促进2条DNA序列相互结合,从而形成超分子自组装的CMPDNA共聚序列.经原子力显微镜和透射电子显微镜表征,该共聚物形成了直径约为25nm、尺寸均一的纳米粒子.在目前为数不多的CMP-DNA共聚序列正交自组装研究中,该实验结果有助于人们探索自然界中多组分系统的自组装行为.; 黄静郑虹宁许菲; 关键词：DNA 自组装生物材料

Significantly improving extracellular enzymes production in Escherichia coli by overexpressing D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase: Escherichia coli is the most widely used species of bacteria for recombinant protein production,but most of re...; 卢潇刘龙杨海泉许菲; 文献传递

基于GPU的生物大分子计算平台的构建与优化: 2017年; 通过生物大分子计算平台对分子动力学的模拟运算,计算值可以描述分子的运动轨迹,从而揭示原子间的内在关系,但这一过程较为复杂且昂贵。作者研究了较低投入下大分子计算平台的构建与优化,在并行GPU条件和CUDA体系下使用AMBER软件包完成分子动力学的模拟运算。通过对两个大分子体系的运算,实验结果表明计算平台达到了60倍的计算加速,实现了较高的加速性能,完成了高性价比的高性能计算平台的建设。; 俞伟宁璐璐许菲; 关键词：生物大分子分子动力学图形处理单元

果糖基转移酶在大肠杆菌中的重组表达及酶学性质被引量：1: 2018年; 以pET28a为载体实现了黑曲霉来源的果糖基转移酶基因fru在大肠杆菌BL21(DE3)中的异源表达,并研究分析了纯化后重组果糖基转移酶的酶学性质。结果显示,表达后重组果糖基转移酶的酶活力为18.4 U/mg,纯化后比酶活力为706.6 U/mg。温度45℃、pH 5.5为重组果糖基转移酶的最佳酶促反应条件。重组果糖基转移酶的Km、Vmax、kcat分别为1.8 mol/L、8.2 mmol/(L·min)、2558.5 s-1。反应体系中添加葡萄糖至终浓度为50.0 g/L和100.0 g/L时,酶的Ki值分别为3.4 mol/L和0.3 mol/L。反应体系中添加终浓度为1.0 mmol/L的Co^(2+)、Mn^(2+)或Zn^(2+)离子对重组果糖基转移酶的催化反应具有显著促进作用。; 宋春丽杨海泉马道程许菲; 关键词：果糖基转移酶 E.COLI 酶学性质

胶原蛋白异源三聚体的理性设计被引量：3: 2019年; 胶原蛋白是高等动物中最丰富的蛋白质,约占总蛋白质量的1/3.同时,胶原又是重要的生物医用材料,被广泛应用在伤口缝线、软骨缺损填充、骨骼金属植入物镀膜等.目前,在已知的人类28种胶原蛋白中,其中有1/4的胶原构型(7/28)是以异源三聚体的形式存在.由于缺乏对胶原蛋白链间特异性识别与折叠机制的了解,如何通过理性设计来制备清洁来源、纳米尺度可调控的胶原蛋白材料一直是蛋白质工程与生物材料工程交叉领域中的热点和难点问题.迄今为止,在胶原三螺旋中鉴定的最重要的成对相互作用是轴向电荷对,其可以在适当放置的赖氨酸与天冬氨酸或谷氨酸残基之间形成.这些成对氨基酸相互作用将允许制备具有高特异性的异源三聚体螺旋,以及对螺旋结构和稳定性的总体改进控制.此外,对这些相互作用的详细研究将帮助我们修改天然胶原蛋白序列,制造清洁来源、高度可控和成分响应的胶原蛋白生物材料.本综述将总结我们对这种相互作用和其他电荷对相互作用的理解,以及它们如何成功地用于控制胶原三螺旋自组装并探索新的蛋白质设计策略.; 吕成强书敏孙添添许菲; 关键词：胶原蛋白

启动子改造及发酵条件优化提高人源Ⅲ型胶原蛋白在毕赤酵母中的表达量: 2020年; 通过微生物异源表达胶原蛋白能够避免传统提取方法存在的有致病隐患和水溶性低的问题,也能突破化学合成方法对胶原蛋白长度的限制,使得对胶原序列的设计更加灵活.本文合成了截短的人源Ⅲ型胶原蛋白N-HC3240基因,为提高其在毕赤酵母中的表达量,通过启动子改造策略,研究了启动子AOX1、DAS1、DAS2、FLD1、FDH1、THI4和THI11对N-HC3240在毕赤酵母GS115中表达的影响,结果表明AOX1启动子是N-HC3240时空表达量最优的启动子.此外,对AOX1启动子的启动表达,进行了溶氧、初始诱导菌体浓度、诱导pH值和甲醇浓度的优化,最终N-HC3240在摇瓶水平的产量达到0.28 g/L,是优化前的2.5倍,并通过质谱鉴定了N-HC3240的序列.本研究为人源Ⅲ型胶原蛋白在毕赤酵母中的异源高效表达提供了一定的研究基础.; 刘超张萌许菲; 关键词：毕赤酵母GS115 启动子发酵优化

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许菲

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