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弓形虫GRA6-GRA2蛋白表达及检测应用: 2023年; 为建立一种敏感性好、特异性强、方便快捷的检测猫弓形虫抗体的方法,本研究通过分子生物学方法、优化合成了GRA1-GRA7、SAG1和GRA6-GRA2基因,采用大肠杆菌ER2566表达了GRA1-GRA7、SAG1和GRA6-GRA2三种蛋白;表达产物利用His亲和层析柱纯化后,经Western blot鉴定三种蛋白表达产物都有较好的抗原特异性;通过ELISA方法进行检测比较,确定GRA6-GRA2蛋白敏感性最高;以GRA6-GRA2蛋白作为标记抗原,制备弓形虫抗体检测试纸条,分别对敏感性对照阳性血清、特异性对照血清进行检测,并与弓形虫抗体间接血凝法对289份临床血清进行对比检测。结果表明:检测敏感性对照阳性血清可检测至1∶256,检测临床常见的猫细小病毒阳性血清、猫杯状病毒阳性血清和猫疱疹病毒阳性血清结果均为阴性;在弓形虫抗体检测试纸条和弓形虫抗体间接血凝法对289份临床血清的对比检测中,阳性率分别为2.42%和2.07%,符合率为99.5%。通过以上结果可知,采用GRA6-GRA2蛋白作为诊断抗原制备的胶体金试纸,具有良好的敏感性和特异性,为弓形虫病的快速诊断提供了切实可行的检测手段。; 张宁刘伟吴铭洁夏霖亚王蕾殷玉和石晶吴丛梅; 关键词：弓形虫抗原

重组HPV16 L1衣壳蛋白的表达与层析纯化工艺的优化: 2022年; 在大肠杆菌系统中表达重组HPV16 L1衣壳蛋白,并采用实验设计(design of experiments,DOE)对重组蛋白的阳离子交换层析纯化工艺参数进行优化,以获得更高的回收率,为产品生产提供指导。首先,构建表达载体pET-30a-16 L1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,进行诱导表达并应用50 L发酵罐高密度培养工程菌;然后,单因素变量筛选4种阳离子交换层析介质,DOE方法优化上样流速及缓冲液的pH,疏水层析进一步纯化;分析重组HPV16 L1病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)的蛋白纯度、回收率、内毒素、宿主残余蛋白和残余DNA,并进行透射电镜形态观察;最后,HPV16 L1 VLPs免疫小鼠,评价体内所诱导的中和抗体水平。结果显示,筛选并确定pH为8.0的缓冲体系和5 mL/min的上样流速进行POROS^(TM)XS阳离子层析作为蛋白纯化条件,疏水层析进一步纯化;纯化后蛋白浓度为1.0 mg/mL,回收率为46.23%,纯度为97%,内毒素含量小于12.5 EU/mL,宿主残余蛋白为6.00 ng/mL,宿主残余DNA为3.30 ng/mL;小鼠免疫6周后血清的中和抗体滴度Log10平均值为4.01。本研究利用大肠杆菌表达系统成功表达HPV16 VLPs,获得优化后的阳离子交换层析纯化工艺,为VLPs疫苗的研发提供了思路,为DOE在生物工程领域的应用提供依据。; 王蕾孙琦陈放夏霖亚张宁吴铭洁吴丛梅殷玉和; 关键词：蛋白纯化

4种分子伴侣促进猫细小病毒样颗粒可溶性表达的研究被引量：1: 2021年; 为了研究4种分子伴侣在E.coli表达系统中对猫细小病毒(feline Parvovirus, FPV)VP2蛋白表达及其组装的病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs)活性的影响,试验构建重组质粒pET30a-VP2,将重组质粒pET30a-VP2分别与4种分子伴侣pKJE7、pKJE8、pGro7和pTf16转化至E.coli ER2566感受态细胞中进行共表达,运用SDS-PAGE、Western-blot对表达产物进行检测,通过硫酸铵沉淀结合疏水层析柱对表达产物进行纯化,电镜观察VLPs的形态,并采用血凝试验检测其免疫活性。结果表明:重组质粒pET30a-VP2在E.coli表达系统中主要以包涵体形式表达蛋白。4种分子伴侣与重组质粒pET30a-VP2共表达,加入终浓度为2 mg/mL L-阿拉伯糖及0.1 mmol/L IPTG或5 ng/mL四环素的诱导剂,25℃诱导16 h,均能显著提高FPV VP2蛋白的可溶性表达,表达蛋白具有抗原特异性。纯化得到的FPV VP2蛋白在250 mmol/L NaCl(pH值为8.0)条件下可自组装形成均一、直径约为24 nm的VLPs。仅分子伴侣pTf16与重组质粒pET30a-VP2共表达获得的FPV VP2蛋白经透析形成的FPV VLPs正常,无碎片,其血凝效价为219。说明通过将重组质粒pET30a-VP2分别与4种分子伴侣在E.coli表达系统中共表达,4种分子伴侣均可促进FPV VP2蛋白的可溶性表达,成功纯化并获得FPV VLPs。; 夏霖亚吴铭洁王蕾张宁罗国良吴丛梅殷玉和; 关键词：猫细小病毒病毒样颗粒分子伴侣 VP2蛋白可溶性表达

狂犬病病毒抗原的浓缩及纯化工艺的研究: 2020年; [目的]研究狂犬病病毒纯化抗原生产工艺。[方法]通过对聚乙二醇(PEG)沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化、Zn(AC)2沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化、Zn(AC)2沉淀浓缩及Sepharose 4 Fast Flow分离纯化三种方法制备狂犬病病毒纯化抗原进行比较。[结果]Zn(AC)2沉淀浓缩后蔗糖密度梯度离心纯化抗原与Sepharose 4 Fast Flow纯化抗原收获蛋白总量无明显差异。PEG沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化抗原制备的检测试纸条荧光强度较弱。[结论]用Zn(AC)2沉淀法浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化法制备狂犬病病毒抗原。; 张宁龚本义刘冬禹杨丹丹殷玉和吴丛梅; 关键词：狂犬病病毒纯化

细菌纤维素生物合成的研究被引量：5: 2008年; 研究了以玉米浆作为氮源的细菌纤维素生产的主要影响因素。通过优化培养基的方法,提高纤维素的产量,最终确定了木醋杆菌产纤维素的最优发酵液培养基为4%葡萄糖、10%玉米浆、pH6、产膜后的pH值为3.5～4.5,培养温度30℃,纤维素产量可达7.22g/L。; 张海悦张宁; 关键词：细菌纤维素生物合成玉米浆

水貂肠炎病毒VP2基因原核表达及病毒样颗粒制备被引量：3: 2021年; 试验旨在制备水貂肠炎病毒(Mink enteritis parvovirus,MEV)可溶性VP2蛋白及其病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)。优化并合成MEV VP 2基因,克隆至原核表达载体pET-30a(+),将重组质粒pET-30a-VP2与分子伴侣pTf16共同转化到宿主菌ER2566中,以不同培养温度、L-阿拉伯糖浓度和IPTG浓度进行诱导表达,收集样品进行SDS-PAGE和Western blotting分析。通过硫酸铵沉淀结合蔗糖密度梯度离心法对表达产物进行纯化,由SDS-PAGE进行鉴定,透析去除蔗糖,通过动态光散射技术(DLS)和透射电子显微镜(TEM)观察不同组装条件下VLPs的粒径和形态。用制备的MEV VLPs疫苗免疫水貂评价其免疫原性。结果显示,以2 g/L L-阿拉伯糖、0.2 mmol/L IPTG、25℃培养16 h为诱导条件时,VP2蛋白在大肠杆菌中可溶性表达,分子质量约为65 ku。经Western blotting鉴定VP2蛋白具有良好的抗原特异性。将此表达产物利用硫酸铵沉淀结合蔗糖密度梯度离心法纯化后,纯度可达90%以上。在pH 8.0,150 mmol/L NaCl的透析液中,VP2经自组装可形成与天然MEV形状和粒径相似且具有血凝特性(1∶214)的VLPs。VLPs疫苗免疫水貂21 d后,测得水貂血清中的血凝抑制(HI)抗体水平均相对最高,可达1∶211,说明该VLP疫苗有较好的免疫原性,能有效预防MEV的感染。本试验结果表明,将pET-30a-VP2与pTf16在原核表达系统中共表达,可获得具有高免疫原性的VLPs,为后期MEV VLPs疫苗的研发奠定基础。; 吴铭洁夏霖亚王蕾张宁罗国良殷玉和吴丛梅; 关键词：VP2 原核表达病毒样颗粒

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张宁

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