李丽红
- 作品数：9 被引量：19H指数：3
- 供职机构：北京林业大学生物科学与技术学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 毛白杨酵母单杂交体系的建立被引量：2
- 2015年
- 【目的】通过建立酵母单杂交文库筛选出与毛白杨特异性调控元件结合的候选蛋白,为研究毛白杨木材合成相关基因奠定基础。【方法】采用模板基因PCR方法,分别将ABRE-box、AC-box及-317-Box三次重复序列连接至p Ab Ai诱饵质粒上,再将诱饵载体转入酵母中;使用磁珠法获得m RNA,采用SMART技术合成c DNA,以c DNA为模板进行LD-PCR并将产物纯化后与p GADT7-Rec载体共转化诱饵酵母,同时进行文库的构建与筛选。【结果】以p BI121质粒为模板扩增获得的ABRE/AC/-317-GUS片段约为650 bp。以KpnⅠ对重组质粒p Ab Ai-ABRE/AC/-317-GUS进行单酶切,获得约5000 bp的大片段与650 bp的小片段;测序结果表明,插入序列与ABRE/AC/-317序列一致且方向正确。在SD/Ura培养基中,当Ab A为100 ng/m L时,酵母菌落数为0,建库时Ab A为100 ng/m L。c DNA与p GADT7载体共转化的酵母Y1HGold(p AC-Ab Ai)细胞稀释100倍后,在SD/-Leu培养基上长出89个克隆,含AC-box的诱饵酵母所建库容量为1.3×106,且无r RNA污染。酵母转化产物在SD/-Leu/Ab A(100 ng/m L)培养基上长出18个克隆,大于250 bp的有13个克隆;测序和同源分析结果表明,成功筛选到5个候选蛋白,主要是蛋白激酶、核小体蛋白及功能未知蛋白,这些蛋白可作为与AC元件结合的候选蛋白。【结论】建立的毛白杨酵母单杂体系可用于进一步筛选与木材合成相关的基因。
- 刘蕾胡旭东张强蒋璐瑶李丽红要笑云陆海
- 关键词：毛白杨文库构建
- 毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因PtCP3的基因克隆和原核表达分析被引量：2
- 2016年
- 为研究毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因PtCP3的酶学特征和生理功能,本实验对PtCP3进行了基因克隆和原核表达分析。从毛果杨(Populus trichocarpa Torr.&Gray)中克隆得到半胱氨酸蛋白酶基因PtCP3,将其克隆至pMD-18T载体。进一步构建原核表达载体pET30a-PtCP3,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中成功诱导表达重组蛋白,然后通过包涵体洗涤法对目的蛋白进行纯化。测序结果表明,PtCP3基因CDS序列全长1074 bp,含有木瓜蛋白酶的保守催化位点和组织蛋白酶B的保守结构域。序列分析结果显示,半胱氨酸蛋白酶基因PtCP3编码357个氨基酸,预测N-末端含有长度为27个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽后蛋白酶大小为36.515 kDa,理论等电点为7.44。SDS-PAGE电泳结果显示,可以检测到大小约为42 kDa的目的条带,并可通过包涵体洗涤法在体外得到了高表达量、单一的重组蛋白PtCP3。
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- 关键词：半胱氨酸蛋白酶基因克隆原核表达蛋白纯化
- 毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4原核表达及蛋白纯化被引量：1
- 2016年
- 【目的】对毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因Pt CP_2和Pt CP4进行原核表达及重组蛋白纯化,为进一步研究该基因的酶学特征和生理功能打下基础。【方法】从毛果杨中克隆两个半胱氨酸蛋白酶基因Pt CP_2和Pt CP4,构建其原核表达载体p ET-30a-Pt CP_2及p ET-30a-Pt CP4,并在转入大肠杆菌后在体外诱导表达重组蛋白,采用包涵体洗涤法对目的蛋白进行纯化。【结果】Pt CP_2基因CDS序列全长1107 bp,编码368个氨基酸;Pt CP4基因CDS序列全长1104 bp,编码367个氨基酸。Pt CP_2和Pt CP4基因编码的蛋白均属于RD19A-like类型木瓜蛋白酶。Pt CP_2和Pt CP4基因在毛果杨根、茎、叶中均有表达,其中Pt CP_2在叶中表达量最高,Pt CP4在根中表达量最高。通过包涵体洗涤法在体外得到了高表达量、单一的重组蛋白Pt CP_2和Pt CP4,切除信号肽后蛋白酶大小分别为38.151和38.069 k D。【结论】原核表达获得的纯化重组蛋白Pt CP_2和Pt CP4可用于进一步研究毛果杨半胱氨酸蛋白酶的酶学特征和生理功能。
- 张强李丽红要笑云蒋璐瑶王莹撖静宜曹山李慧陆海
- 关键词：半胱氨酸蛋白酶原核表达蛋白纯化定量PCR
- 油松端粒长度与树龄相关关系研究被引量：4
- 2015年
- 端粒是位于染色体末端能够保护染色体维持其稳定性的特殊DNA-蛋白复合物,与细胞分裂、细胞衰老及寿命都有着密不可分的联系。结合前人对银杏、狐尾松等木本植物端粒长度与树龄相关关系的研究,选取我国特有常绿木本裸子植物油松作为试验材料,采集树龄跨度从7年到800年9个年龄段的针叶,采用TRF测定法对油松针叶端粒长度进行了测定。结果表明,随着油松树龄的增加,针叶端粒长度也相应变长。在此基础上,建立了油松端粒长度和树龄相关关系的数学模型,以期利用这一数学模型,可以在不损伤树体的前提下,用更为快捷方便的实验手段对古树树龄进行准确测定。
- 胡旭东撖静宜要笑云李丽红蒋璐瑶陆海刘頔
- 关键词：油松端粒长度树龄数学模型古树保护
- 单、重瓣玉簪花器官分化和花形态学比较研究被引量：4
- 2014年
- 以单瓣和重瓣玉簪为试验材料,采用石蜡切片法和显微技术研究了其花器官分化和花形态发育过程的差异,为进一步研究单、重瓣玉簪形成的分子机制奠定形态学基础。结果表明:(1)单瓣花和重瓣花的花芽分化过程均可分形态分化前期、被片原基分化期、雄蕊原基分化期、雌蕊原基分化期4个时期,各轮花器官按照向心顺序发育。(2)单瓣花包含6枚呈两轮排列的花被片、6枚雄蕊和1枚雌蕊,而重瓣花包含6枚呈两轮排列的花被片,6枚由雄蕊同源转化成的被片,中央心皮愈合不完整。
- 张丹丹王莹荀志丽李丽红陆海刘頔
- 关键词：玉簪花器官花芽分化
- 拟南芥转录因子LFY2的表达和功能分析被引量：3
- 2020年
- 为研究转录因子LFY2的表达和功能,本文以拟南芥为材料研究了LFY2定位和表达特性。使用GFP融合蛋白技术分析LFY2的亚细胞定位,结果显示LFY2定位在细胞核中;定量PCR检测拟南芥不同组织及不同发育时期花中LFY2的相对表达量,结果显示LFY2在花苞中表达量最高;原位杂交检测显示LFY2在拟南芥花药发育的第7时期在绒毡层中开始表达,并在7~12时期持续表达,说明LFY2在花药绒毡层的发育过程中起一定作用。该研究为进一步探究LFY2在花药发育中的功能提供了一定的实验数据。
- 赵芝婧李丽红要笑云刘頔
- 关键词：拟南芥亚细胞定位原位杂交花药发育
- 毛果杨中链酰基辅酶A合成酶的克隆及酶学分析被引量：3
- 2016年
- 中链酰基辅酶A合成酶(MACS)属于腺苷酸合成酶超基因家族,催化中链脂肪酸与辅酶A结合形成相应的中链酰基辅酶A。本研究通过同源检索毛果杨基因组数据库中的4CL基因,克隆得到毛果杨Pt MACS1的基因序列(基因编号:est Ext_fgenesh4_pg.c_640066)。通过序列分析可知,Box I和Box II两个在4CL中保守的结构域在该蛋白中并不保守。将Pt MACS1与原核表达载体p ET-30a(+)构建融合表达载体Pt MACS1-p ET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白进行表达。镍柱纯化重组蛋白后进行酶学活性分析,研究结果表明该蛋白对中链脂肪酸己酸、壬酸、癸酸显示出明显活性:Kcat分别为(130±2.65)、(193±3.46)、(201±5.51)μmol/(min·mg),以该蛋白的最适底物癸酸测得该蛋白的最适反应温度为37℃,最适反应p H为7.0。该结果表明,Pt MACS1属于毛果杨中链酰基辅酶A合成酶家族一员,为后续毛果杨腺苷酸合成酶超基因家族的鉴定及分类分析提供资料。
- 曹山蒋璐瑶李丽红要笑云张强撖静宜王莹李慧陆海
- 关键词：MACS克隆原核表达酶学分析
- 毛果杨漆酶基因LAC-1的克隆与原核表达研究
- 2016年
- 目的:克隆毛果杨漆酶基因LAC-1,对其进行生物信息学分析,并构建原核表达载体在大肠杆菌中进行融合蛋白的诱导表达并纯化目的蛋白,为植物漆酶基因蛋白体外结构与功能的研究提供一定的理论基础。方法:根据同源克隆的原理,利用已经研究公布的拟南芥中的漆酶基因序列对毛果杨基因组数据库进行同源检索,利用PCR技术克隆毛果杨漆酶基因的序列,构建重组表达载体,转化大肠杆菌BL21并表达重组蛋白,通过Ni-NTA亲和层析进行纯化。结果:克隆获得了毛果杨漆酶基因的序列(命名LAC-1,基因登录号XP_002310245),序列分析表明LAC-1具有漆酶基因的保守结构域,进化树分析表明该序列与拟南芥的漆酶基因AtLAC4有较高的同源性,利用所构建的原核表达载体,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测结果表明表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论:LAC-1属于毛果杨基因家族的一员,该漆酶基因可以在体外成功进行原核表达,为毛果杨漆酶基因家族成员的鉴定及后续活性功能的分析提供了一定的理论基础。
- 李丽红撖静宜王莹曹山张强蒋璐瑶要笑云李慧陆海
- 关键词：LAC基因克隆原核表达
- 利用酵母单杂交文库技术筛选银杏端粒结合蛋白
- 2016年
- 目的:为了获得与银杏端粒结合序列相结合的端粒结合蛋白,为木本植物端粒结合蛋白的研究提供实验依据,从而丰富对银杏端粒的研究。方法:以银杏叶片为实验材料,利用酵母单杂交文库筛选获得可能为银杏端粒结合蛋白的基因片段,并通过GFP酵母单杂交实验验证获得基因片段与端粒序列的结合特异性。结果:使用端粒特异性结合序列(TTTAGGG)3的诱饵载体没有获得合适大小的扩增片段,而使用端粒特异性结合序列(TTTAGGG)5的诱饵载体成功获得52个扩增片段,这说明端粒DNA序列(TTTAGGG)3过短,不利用蛋白质的结合。比较这些扩增片段序列并去除相同序列,结果显示这52个扩增片段分别属于10个基因片段。对这10个基因片段进行进一步序列分析,并使用酵母单杂交技术验证,结果显示其中一个基因能够与银杏端粒序列特异性结合。结论:本研究通过酵母单杂交文库筛选,GFP酵母单杂交验证等实验方法建立了银杏端粒结合蛋白的筛选方法,并成功获得了一个和银杏端粒重复序列特异性结合的端粒结合蛋白。
- 蒋璐瑶李丽红要笑云张强撖静宜王莹李慧陆海刘頔
- 关键词：银杏端粒结合蛋白酵母单杂交
