刘萌
- 作品数：3 被引量：7H指数：2
- 供职机构：江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- SUMO蛋白酶Ulp1的高效表达纯化并通过His-SUMO标签制备scFv被引量：4
- 2018年
- SUMO蛋白酶（Ulp1）是切割小分子泛素修饰（SUMO）融合蛋白获得天然N端靶蛋白的一种工具酶,具有酶切效率高、特异性好等优点。但现有市售SUMO蛋白酶Ulp1价格昂贵、操作复杂,限制了SUMO融合体系的运用。利用基因工程技术,合成基因ulp1（Leu403-Lys621）,并在N端和C端加入多聚组氨酸标签（His_6）,构建重组表达载体psv T7-ulp1,将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）和BL21 trx B（DE3）中。经过高通量筛选技术快速确定最优的表达条件为采用BL21（DE3）作为表达宿主,转接后7h加入IPTG,IPTG的终浓度为0.1mmol/L,诱导时间为16h,最终蛋白质表达量占菌体总蛋白质量的34.5%,重组蛋白Ulp1的表达量为190mg/L,通过Ni-NTA一步纯化即可得到纯度95%以上的Ulp1。通过酶切反应,测定酶活为5.19U/μl,比酶活为5.23×10~4U/mg,是先前报道比酶活的1.87倍,通过酶活动力学分析,Ulp1的表观米氏常数K_m=0.359g/L,V_m=5.10μg/（ml·min）。将SUMO融合表达体系用于单链抗体（single-chain antibody fragment,scFv）的表达,得到可溶的SUMO-scFv融合蛋白,使用表达的Ulp1进行酶切并纯化,获得纯度高于90%且N端不含多余氨基酸的scFv,操作步骤简单,显著改善了scFv在大肠杆菌中难以高效可溶性表达纯化的现状。
- 李诗洁杨艳坤杨艳坤白仲虎刘萌
- 关键词：SUMOSCFV
- 人-鼠嵌合单链抗体的构建及其在大肠杆菌中的高效可溶性表达和发酵条件优化被引量：4
- 2016年
- 从人血清白蛋白HSA免疫小鼠制备的杂交瘤单克隆抗体细胞中提取总RNA,通过反转录得到c DNA,经RT-PCR的方法扩增出单克隆抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL的DNA编码序列,通过基因重组的方法将鼠源Fab段VH和VL与人源Fab段重链和轻链恒定区进行嵌合,获得人源化嵌合单链抗体(Single-chain Antibody Fragment,sc Fv),将sc Fv克隆到构建的表达载体p BY中导入到宿主菌BL21-trx B(DE3)中进行可溶性表达,在摇瓶水平通过对发酵条件进行优化,胞内可溶性表达量达到1.23 g/L,在此基础上进行反应器放大培养,对关键参数进行优化,sc Fv表达量达到2.49 g/L。通过人源化嵌合抗体的构建表达并完成了小试水平的研究,为进一步开发人源化单链抗体提供了方法和研究基础。
- 刘萌孙杨杨艳坤白仲虎
- 关键词：SCFV可溶性表达酶联免疫吸附发酵条件优化
- 大肠杆菌中dAb一级结构与可溶性表达关联
- 2017年
- 抗体类药物研发是药物发展的一个重要研究方向,目前已有许多抗体在原核表达体系中成功表达。人们通常采用"试错法"优化表达系统,提高蛋白质产量,但该方法费时费力且成功率低,因此迫切需要探索氨基酸组成与蛋白质可溶性表达水平之间的关联,以指导表达系统的选择或蛋白质分子的定向改造。在单域抗体dAb分子的C端末尾添加一个氨基酸,发现单个氨基酸的改变足以引起蛋白质可溶性表达量发生显著变化。通过层次聚类、Cluster Omega对dAb氨基酸序列与表达水平分别进行分类,发现两者分类一致的比例达到70%,证明了氨基酸序列与蛋白质表达水平间的关联。通过对65个CDR随机突变的dAb分子进行线性建模分析其可溶性表达量,发现对dAb胞外质量分数有显著影响作用的氨基酸组合为S(丝氨酸),R(精氨酸),N(天冬酰胺),D(天冬氨酸),Q(谷氨酰胺),Y(酪氨酸),F(苯丙氨酸),G(甘氨酸),对dAb胞内质量分数有显著影响作用的氨基酸组合为G,R,C(半胱氨酸),N,S,Y,K(赖氨酸),A(丙氨酸),对dAb蛋白质总量有显著影响的组合为R,S,G,N,Y,C,Q,F,T(苏氨酸)。其中R、S和G的含量显著影响dAb的可溶性表达量且该影响不受分布位置的影响。蛋白质的极性亦是其可溶性表达水平的显著影响因素。
- 郭雯雯刘萌刘萌杨艳坤戴晓峰
- 关键词：DAB氨基酸组成可溶性表达聚类分析
