李梅
- 作品数：4 被引量：2H指数：1
- 供职机构：黑龙江大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：教育部留学回国人员科研启动基金黑龙江省普通高校骨干教师创新能力资助计划黑龙江省自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 昆虫细胞中表达eGFP基因的重组杆状病毒的构建
- 2013年
- 为构建表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)融合蛋白的昆虫杆状病毒转移载体。利用Sf-9细胞表达eGFP,用PCR法从重组Bacmid和pEGFP-C3质粒中扩增gp64SP、eGFP和VSVGED片段,利用一步法SOE-PCR将3个片段连接在一起。用XbaI和HindIII酶切融合片段与pFastBacPH,连接获得阳性质粒命名为pFB/LM-PH。转化E.coliDH10Bac,通过转座子Tn7的介导,获得重组杆状病毒Bv-LM-PH,感染Sf9昆虫细胞。结果表明:通过倒置荧光显微镜观察细胞形态及荧光表达情况;结果证实:感染的Sf9细胞可表达外源基因eGFP。重组pFB/LM-PH载体具备表达eGFP的能力,为分子生物学研究提供了一种新型可表达eGFP融合蛋白的昆虫杆状病毒表达载体。
- 唐晓艳高冬妮李梅葛菁萍平文祥楼庄伟
- 关键词：昆虫杆状病毒表达系统增强型绿色荧光蛋白昆虫细胞
- 构建具有巨细胞病毒(CMV)启动子的杆状病毒高效表达载体并利用其在鸡胚原代细胞中表达eGFP基因被引量：1
- 2013年
- 【目的】杆状病毒载体在哺乳动物细胞中不复制,具有极高的生物安全性,而通过引入细胞特异性启动子、"病毒假型化"、添加不同功能调控元件等优化手段,杆状病毒可转导的细胞类型明显增多、转导效率明显增高。优化的重组杆状病毒可以在鸡细胞中表达,确定重组杆状病毒在鸡细胞中高效表达的条件,为禽类基因工程疫苗的开发奠定了坚实的基础。【方法】本研究以增强型绿色荧光蛋白(Enhanced GreenFluorescent Protein,eGFP)为报告基因,构建含巨细胞病毒(Cytomegaoviyns,CMV)启动子启动的重组转座载体,并且通过病毒假型化(TM/CTD of VSV-GED)、添加转录后调控元件(Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element,WPRE)和腺病毒反向重复序列(Inverted terminal repeats,ITRs)等手段优化重组杆状病毒表达载体,最终利用重组杆状病毒对鸡胚原代细胞的侵染进行eGFP的表达,比较分析不同重组载体对蛋白表达水平的影响。【结果】eGFP表达结果显示,12 h便可在倒置荧光显微镜下检测出eGFP的表达,随着时间的延长,eGFP表达效率先增加后降低。经过VSVGED病毒假型化的重组杆状病毒转导效率从36%增加至48.2%。添加转录后调控元件WPRE的重组杆状病毒介导eGFP的表达效果与添加10mmol/L丁酸盐法基本相同,但对细胞几乎没有毒性。从72 h内的eGFP表达强度看,只有添加ITRs元件的重组杆状病毒的表达强度随时间的延长而极缓慢增加。【结论】eGFP表达结果显示,利用VSVGED病毒假型化手段可以提高杆状病毒转导鸡胚原代细胞的效率;添加转录后调控元件WPRE的重组杆状病毒介导eGFP的表达效果与添加丁酸盐法基本相同,可以增强杆状病毒介导报告基因在鸡胚原代细胞中的表达水平;添加ITRs元件的重组杆状病毒具有延长eGFP表达时间的作用。
- 宋姗姗葛菁萍李梅高冬妮金丽颖安琦平文祥楼庄伟
- 关键词：杆状病毒调控元件
- 杆状病毒介导的哺乳动物细胞基因转移及其影响因素被引量：1
- 2009年
- 杆状病毒作为优良的哺乳动物细胞基因转移载体已在基因治疗、疫苗开发、药物筛选以及基因调控研究等方面发挥巨大作用。但杆状病毒对哺乳动物细胞的嗜性不够广泛、转导效率和转基因表达水平偏低,以及表达持续时间短暂等问题制约其进一步发展,因此如何突破这个制约的瓶颈成为学者们新的关注焦点。针对以上问题,围绕杆状病毒介导哺乳动物细胞基因转移的各种影响因素进行综述。
- 李梅王昆葛菁萍高冬妮楼庄伟平文祥
- 关键词：基因转移哺乳动物细胞
- 腺病毒反向重复序列ITRs的人工合成与克隆
- 2009年
- 为获得高GC含量(72%)的腺伴随病毒AAV反向末端重复序列ITRs(178 bp),以自行设计的4段寡核苷酸引物(约59 bp)为模板,采用融合PCR方法将其人工合成。回收目的片段后,通过TA克隆、PCR和酶切鉴定获得8个阳性转化子。经测序鉴定,得到了5个序列完全正确的克隆。本实验为研究含有ITRs的重组杆状病毒介导外源基因在哺乳动物细胞中表达持续时间的影响奠定了基础。
- 王昆葛菁萍李梅隋栋高冬妮楼庄伟平文祥
- 关键词：PCR基因合成
