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两种主要甜樱桃病毒RT-PCR检测方法的改进被引量：6: 2011年; 李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot vi-rus,PNRSV）和李矮缩病毒（Prune dwarf virus,PDV）是较为常见且危害严重的两种植物病毒,1992年被我国列为进境检疫危险性有害生物,主要危害李属和蔷薇属植物。反转录-聚合酶链式反应检测法（RT-PCR）因操作简便且灵敏度高而备受青睐。; 宗晓娟王文文陈立伟王甲威严雪瑞刘庆忠; 关键词：环斑病毒反转录-聚合酶链式反应甜樱桃危险性有害生物蔷薇属植物植物病毒

李矮缩病毒外壳蛋白基因克隆及原核表达研究被引量：5: 2012年; 为制备李矮缩病毒（prunusdwarfvims，PDv）抗血清，克隆PDV外壳蛋O（ce）基因，构建原核表达载体，优化蛋白表达条件。以阳性感病甜樱桃叶片为试验材料，提取总RNA，根据PDVCP基因（L28145．1）设计特异引物，RT-PCR方法扩增，克隆、测序，构建原核表达载体pET30a-PDVCP，在大肠杆菌BL21（DE3）菌株表达。PDV凹基因（GenBank登录号：JF333587．1）全长657bp，编码217个氨基酸。与GenBank其他PDV分离物CP基因核苷酸序列的同源性为89．2％-93．9％，推导的氨基酸序列同源性为97％-99％。根据完整CP基因核苷酸序列构建系统进化树显示：12个PDV分离物可分为3组，泰安分离物与巴西、土耳其等分离物属于I组。成功构建原核表达载体pET30a．PDVCP，并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。转pET30a．如Ⅵ≯载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株表达分子量约24kDa的重组蛋白。该重组蛋白在30℃，1．0mmol／LIPTG、诱导4h表达量最大。; 陈立伟宗晓娟王文文王甲威魏海蓉徐丽严雪瑞刘庆忠; 关键词：外壳蛋白基因克隆原核表达

山东地区樱桃绿环斑驳病毒(CGRMV)的RT-PCR检测及外壳蛋白基因的克隆被引量：3: 2012年; 为调查我省甜樱桃感染樱桃绿环斑驳病毒(Cherry Green Ring Mottle Virus,CGRMV)情况,本研究以甜樱桃(Prunus avium L.)品种"红灯"叶片总RNA为模板,根据CGRMV基因组序列设计特异引物,对山东地区37份甜樱桃"红灯"样品进行RT-PCR检测,共检测出19份阳性样品。利用CGRMV外壳蛋白基因序列引物,从阳性植物样本中分离到约800 bp的目的片段,克隆测序,序列分析显示该片段全长807 bp,编码268个氨基酸,与GenBank中已登录的CGRMV分离物的外壳蛋白基因序列一致性为87%～97%,氨基酸序列相似性为95%～99%。该结果表明山东地区甜樱桃生产园中感染CGRMV的病例较为普遍。; 王文文宗晓娟陈立伟王甲威魏海蓉徐丽孟艳玲严雪瑞刘庆忠; 关键词：甜樱桃 RT-PCR检测外壳蛋白基因克隆

中国甜樱桃病毒病及其检测技术研究进展被引量：9: 2012年; 综述了近年来中国对甜樱桃(Prunus avium L.)病毒病及其检测技术的相关报道,介绍了中国甜樱桃上常见病毒的种类、危害及特性,主要包括:李属坏死环斑病毒(PNRSV)、李矮缩病毒(PDV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、樱桃锉叶病毒(CRLV)、樱桃病毒A(CVA)、樱桃绿环斑驳病毒(CGRMV)、樱桃小果病毒(LChV);阐述了甜樱桃病毒检测中所用的方法、技术,包括指示植物法(生物学鉴定法)、电子显微镜技术、血清学方法、分子生物学技术方法等。; 王文文宗晓娟陈立伟王甲威魏海蓉徐丽严雪瑞刘庆忠; 关键词：AVIUM 病毒

樱桃病毒A外壳蛋白基因克隆及其原核表达被引量：5: 2012年; 为制备樱桃病毒A(Cherry virusA,CVA)抗血清,克隆CVA外壳蛋白基因(CP),构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。根据CVA全基因组序列(NC_003689.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增CVA外壳蛋白基因,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-CVACP,转化大肠杆菌BL21(DE3)株系,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。序列分析显示,该区段长为603bp,编码201个氨基酸,与法国分离物PF(HQ267856.1)的同源性为96.8%,与印度分离物JKSPMi-5(FN669548.1)同源性为86.3%。成功构建了原核表达载体pET30a-CVACP,SDS-PAGE电泳分析显示,转pET30a-CVACP载体的BL21(DE3)菌株表达分子量约24kDa的重组蛋白,该重组蛋白在37℃、1.5mmol/L IPTG、诱导4h条件下表达量最大。; 陈立伟宗晓娟王文文王甲威魏海蓉徐丽严雪瑞刘庆忠; 关键词：外壳蛋白基因克隆原核表达

甜樱桃李属坏死环斑病毒(PNRSV)及李矮缩病毒(PDV)的RT-PCR检测方法的改进及应用: 以山东泰安地区甜樱桃(Prunus avium L.)品种“红灯”叶片总RNA为模板,以随机六聚体引物替代特异引物进行反转录合成cDNA,采用PNRSV及PDV外壳蛋白编码基因片段引物进行PCR扩增,结果从样品中分别扩增...; 宗晓娟王文文陈立伟王甲威严雪瑞刘庆忠; 关键词：甜樱桃病毒检测; 文献传递

甜樱桃李矮缩病毒(PDV)RT-PCR检测方法的优化与应用: 2012年; 以甜樱桃(Prunus avium L.)品种红灯的叶片为材料,提取总RNA,选用随机六聚体引物进行反转录合成cDNA,根据李矮缩病毒外壳蛋白基因设计2对特异引物,分别从感病样品中扩增出与预期片段大小相符的目的片段。通过对RT-PCR反应体系中引物、模板浓度和退火温度的优化,改进了现有的李矮缩病毒的RT-PCR检测方法,并成功用于山东泰安地区甜樱桃果园的病毒调查。另外,还可以扩增18 sRNA,实现对李矮缩病毒外壳蛋白基因表达的相对定量分析。; 王文文刘庆忠宗晓娟陈立伟王甲威魏海蓉徐丽严雪瑞; 关键词：甜樱桃 RT-PCR检测

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陈立伟