方健
- 作品数：2 被引量：6H指数：1
- 供职机构：华中农业大学水产学院更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划河南省科技攻关计划博士科研启动基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 团头鲂oct4基因真核表达载体的构建与表达
- 2021年
- 八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4,Oct4)在干细胞多能性维持、胚胎早期发育和体细胞重编程等过程中具有重要作用,构建团头鲂oct4基因真核表达载体可为进一步研究该基因的功能提供实用工具。通过PCR方法从含有团头鲂oct4基因开放阅读框序列的载体pCS2+Maoct4中获得基因编码片段,连入真核表达载体pCVpr,构建重组的融合表达载体pCMV-Maoct4-Red;经酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将该载体转染HepG2细胞,观察到细胞中红色荧光主要定位于细胞核,并采用Western blot方法分析融合蛋白的正确表达。成功构建了团头鲂oct4基因荧光真核表达载体pCMV-Maoct4-Red,该载体可用于真核细胞的核定位标记,为后续研究鱼类oct4基因的作用机制奠定了基础。
- 于淼潘启华王乾方健薛亭陈天圣
- 关键词：团头鲂OCT4真核表达载体亚细胞定位
- 青鳉prdm14的原核表达、多克隆抗体制备及其应用被引量：6
- 2017年
- 青鳉(Oryzias latipes)是研究遗传发育和细胞多能性的重要模式鱼类,为探究prdm14同源基因的潜在作用,实验将青鳉prmd14经原核表达后制备了兔抗Prdm14多克隆抗体。首先,将prdm14基因的部分编码区连接到p ET32a质粒中,构建重组表达载体p ET32a-prdm14?600。随后将重组载体转化至大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3),经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,获得分子量为60 k D的Prdm14重组蛋白。接着大量诱导蛋白表达并切胶纯化,免疫家兔(Oryctolagus cuniculus),6周后获得阳性抗体,最后通过ELISA和Western blot检测抗体效价及其特异性。结果显示,在37℃、0.6 mmol/L IPTG、诱导3h的条件下,可获得Prdm14重组蛋白的高效表达;制备的兔抗青鳉Prdm14多克隆抗体能够特异性识别青鳉组织中表达的Prdm14蛋白以及在Hep G2细胞中过表达的青鳉Prdm14:EGFP融合蛋白。综上所述,研究首次制备了一种能有效识别青鳉Prdm14的多克隆抗体,该抗体的获得为后续研究prdm14基因在鱼类多能性干细胞中的作用提供了有力工具。
- 李玲玉方健于淼陈天圣
- 关键词：青鳉原核表达多克隆抗体干细胞
