欧东梅
- 作品数：3 被引量：8H指数：2
- 供职机构：广州军区武汉总医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人Gfi1基因克隆及重组Gfi1慢病毒表达载体的构建被引量：2
- 2009年
- 目的克隆人Gfi1基因的全长cDNA,构建用于真核细胞表达的含有Gfi1基因ORF区的重组慢病毒表达载体pLOX-Gfi1,为研究Gfi1基因的功能打下基础。方法应用RT-PCR从人K562细胞系中扩增出Gfi1 cDNA片段,经回收纯化与pGEM-T载体连接并转化感受态菌DH5α,通过蓝白筛选酶切鉴定出阳性菌落,质粒提取,BamHⅠ限制性内切酶酶切获得目的基因,插入慢病毒载体pLOX中并转化感受态细菌DH5α。质粒提取后进行酶切及PCR鉴定,对阳性克隆进行DNA序列分析。结果RT-PCR扩增获得含有约1.2 kb的DNA片段,酶切及PCR鉴定证实pLOX-Gfi1含有大小正确的正向Gfi1 cDNA,DNA序列分析的结果与发表于GenBank上的序列(NM005263)完全一致。结论成功克隆人Gfi1基因并构建用于真核细胞表达的重组慢病毒载体pLOX-Gfi1。
- 黄敏欧东梅赵霞徐金环张晓梅周剑峰张义成
- 关键词：克隆慢病毒载体
- 人类Gfi1基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立被引量：3
- 2011年
- 目的建立测定人类Gfi1mRNA表达量的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,为进一步研究新基因的功能奠定基础。方法以Gfi1基因为靶基因设计引物。构建携带Gfi1cDNA的质粒plox-Gfi1,经过纯化,质粒浓度测定,拷贝数的计算及10倍的梯度稀释制备标准品。应用ABI stepone PCR仪对Gfi1mRNA进行实时荧光定量PCR检测,建立标准曲线和熔解曲线。结果建立了Gfi1mRNA表达的实时荧光定量PCR方法,本法线性范围为6.36×102～6.36×108copies/μl,线性相关系数γ2为0.996,熔解曲线为单峰,Tm值为(89.98±0.22)℃,标准品的循环阈值批内变异系数和批间变异系数分别为1.35%～3.61%和1.49%～3.42%。结论本研究建立的Gfi1mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法速度快,灵敏度高,特异性强,重复性及稳定性好,可用于Gfi1基因的定量检测。
- 黄敏欧东梅徐金环张晓梅张义成
- 关键词：SYBR实时荧光定量PCR
- 携带人Gfi1基因重组慢病毒载体稳定转染32D细胞株的建立被引量：3
- 2009年
- 本研究建立真核细胞表达的Gfi1基因重组慢病毒载体包装系统,并实现Gfi1在32D细胞中长期、稳定的表达,为进一步研究Gfi1基因在恶性血液病中的发生发展建立一个有效的平台。制备完整的重组慢病毒载体三质粒系统:转移质粒(pLOX-Gfi1/pLOX)、包装质粒(pCMVΔR8.2)及包膜蛋白质粒(pMD.G)。用脂质体法将三质粒共转染包装细胞293T,48小时后收集病毒上清,并转染靶细胞32D;用Western-blot法检测293T及32D细胞中Gfi1的整合及表达。结果表明:慢病毒的3种质粒可以高效转染293T细胞,并成功包装出慢病毒。目的基因Gfi1能被重组慢病毒高效导入靶细胞32D,并稳定表达,在荧光显微镜下可直接观察到GFP。Western-blot能检测到Gfi1蛋白在包装细胞293T及32D细胞中的表达。结论:慢病毒介导的Gfi1基因可以高效稳定转染32D细胞并持续表达,证明本研究建立了一种有效的基因转移系统。
- 黄敏欧东梅吴江赵霞徐金环张晓梅张义成
- 关键词：慢病毒载体
