王岩
- 作品数：5 被引量：3H指数：1
- 供职机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金黑龙江省自然科学基金中央级公益性科研院所基本科研业务费专项更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP4切割天然免疫分子NEMO抑制I型干扰素的产生被引量：3
- 2014年
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)侵入宿主细胞后能够强烈抑制宿主天然免疫反应。早期研究表明,PRRSV 4个非结构蛋白NSP1、NSP2、NSP4和NSP11均可以抑制I型干扰素(IFN-I)的产生,但NSP4抑制IFN-I的机理尚无相关报道。本研究显示PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)导致宿主蛋白NEMO(NF-κB essential modulator)被切割,产生一条约40 ku的蛋白条带。通过检测PRRSV编码蛋白酶的切割功能,进一步表明其NSP4是切割NEMO的关键蛋白酶。免疫共沉淀试验表明NSP4与NEMO具有特异性相互作用;激光共聚焦试验结果表明两者在细胞浆中共定位。通过双荧光素酶报告基因试验显示,NSP4过表达可以显著抑制仙台病毒(SeV)和NEMO诱导的IFNβ启动子的激活,导致IFNβ表达量显著下降(p<0.01)。本研究结果表明,PRRSV NSP4可以切割宿主蛋白NEMO,从而显著抑制IFNβ启动子的激活,从分子水平解释了PRRSV NSP4抑制IFNβ产生的机理。
- 张利杰李江南胡亮张泉王岩于会彬黄丽李曦蔡雪辉翁长江
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒
- 猪脑心肌炎病毒2B蛋白与RACK1蛋白相互作用的鉴定
- 2014年
- 为筛选与猪脑心肌炎病毒(EMCV)2B蛋白相互作用的宿主蛋白,本实验利用酵母双杂交方法筛选BHK-21细胞表达文库制备与EMCV 2B蛋白相互作用的宿主蛋白RACK1蛋白。酵母共转化试验和免疫共沉淀试验表明两者可以特异性结合,激光共聚焦试验表明两者共定位于细胞质中。为定位RACK1与2B蛋白相互作用区域,本研究构建了RACK1截短表达重组质粒,并将其与pCAGGS-Flag-2B共转染HEK293细胞,利用免疫共沉淀试验验证其相互作用区域。结果显示2B蛋白与宿主细胞RACK1蛋白存在相互作用,并且证明相互作用区域位于RACK1蛋白的N端。
- 王岩黄丽崔尚金李江南杨春梅于会彬郭东伟张元峰夏雪山翁长江
- 关键词：猪脑心肌炎病毒酵母双杂交相互作用
- 基于Gluc的马源NLRP3炎症小体激活系统的建立
- 2020年
- 为建立一种快速、敏感的马源NLRP3炎症小体的体外激活检测系统,本研究利用PCR扩增马IL-1β(eqIL-1β)、马Caspase-1(eqCaspase-1)、马ASC(eqASC)和马NLRP3(eqNLRP3),构建重组真核表达质粒pCAGGS-eqIL-1β-flag、pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag、pCAGGS-eqCaspase-1-HA、pcDNA3.1-eqASC-HA和pcDNA3.1-eqNLRP3-HA,分别转染HEK 293T细胞,培养24 h后采用western blot方法检测细胞中各蛋白的表达,结果显示各重组质粒均构建正确,且均在HEK 293T细胞中正确表达;通过质粒共转染HEK 293T细胞依次对NLRP3炎症小体复合物中不同组分进行剂量依赖性试验,培养24 h后采用western blot检测细胞中切割的eqIL-1β蛋白,利用荧光素酶底物检测细胞上清中的荧光强度,结果显示NLRP3炎症小体体外激活系统中各质粒的最适转染剂量分别为pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag 250 ng、pCAGGS-eqCaspase-1-HA 3.12 ng、pcDNA3.1-eqASC-HA 3.12 ng和pcDNA3.1-eqNLRP3-HA 6.25 ng;通过在该系统中加入不同剂量的NLRP3炎症小体激活剂(Nigericin),检测该系统有效性,结果显示细胞中切割的IL-1β蛋白水平以及上清中的荧光强度与Nigericin存在剂量依赖性,表明基于Gluc的马源NLRP3炎症小体体外激活系统正确构建,且其能对马源NLRP3炎症小体激活的相关蛋白和药物进行筛选。本研究建立的马源NLRP3炎症小体的体外激活检测系统为马属动物炎症及炎症小体调控方面的研究提供重要的工具。
- 王岩刘聪那雷王雪峰林跃智王晓钧
- 关键词：IL-1Β
- ANNEXIN A2在脑心肌炎病毒复制中的作用
- 研究背景 脑心肌炎病毒是一个无囊膜的单链小RNA病毒,该病毒能引起多种哺乳动物发生心肌炎和脑炎,还能引起神经疾病,繁殖障碍和糖尿病.EMCV经常被作为糖尿病和病毒性心肌炎的研究模型,在免疫学研究中EMCV也作为双链RNA...
- 王岩黄丽杨春梅翁长江
- 宿主细胞转录因子E2相关因子2对EIAV复制影响的初步研究
- 2022年
- 转录因子E2相关因子2(Nrf2)是细胞重要的调节抗氧化应激的转录因子,其活性状态与病毒感染引起的炎症及免疫清除相关。为研究Nrf2对马传染性贫血病毒(EIAV)复制的影响,本研究通过CRISPR在线设计工具,靶向于Nrf2设计2条特异性sgRNAs,经程序性退火后连接到LentiCRISPRv2-GFP载体中构建重组质粒并分别经测序鉴定正确后,转染HEK293T细胞,24 h后通过western blot筛选沉默Nrf2基因效率最高的sgRNA,结果显示,2条sgRNAs均具有较高的沉默效率。将重组质粒LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N1转染HEK293T细胞,利用流式细胞仪筛选表达GFP的单细胞克隆,并扩大培养后,经western blot和测序鉴定,筛选到2株不表达Nrf2的细胞,这2株细胞基因组均缺失一个碱基T,导致Nrf2基因发生移码突变而无法表达。选择其中一株细胞,将该细胞连续传代,选择第10代(G10)、15代(G15)、20代(G20)细胞经western blot鉴定其遗传稳定性,结果显示各代次细胞均未检测到Nrf2基因的表达,表明该敲除细胞系可稳定遗传,将其命名为HEK293T-Nrf2^(KO)细胞。将EIAV感染性克隆CMV_(3-8)及Nrf2基因回补的感染性克隆CMV_(3-8)+pVR_(1012)-flag-Nrf2分别转染HEK293T-Nrf2^(KO)细胞,24 h后收获细胞和上清,通过western blot分别检测细胞和上清中的病毒蛋白Gag及利用反转录酶活性试验(RT)检测上清中病毒的复制。western blot结果显示,与CMV_(3-8)转染的HEK293T细胞相比,转染CMV_(3-8)的HEK293T-Nrf2^(KO)细胞和上清中病毒蛋白Gag表达均上调约1.5倍,而转染CMV_(3-8)+pVR_(1012)-flag-Nrf2HEK293T-Nrf2^(KO)细胞和上清中的病毒蛋白Gag表达下调约50%;RT的检测结果与western blot的检测结果一致。结果表明Nrf2基因可以抑制EIAV在HEK293T细胞中的表达。通过将相关质粒转染HEK293T细胞包装EIAV假病毒,并将其分别感染HEK293T和HEK293T-Nrf2^(KO)细胞24 h后,分别检测病毒的荧光素酶信号,结果显示,与对照组相比,感染假病毒的细胞病
- 马官芹王岩林跃智王晓钧
- 关键词：NRF2马传染性贫血病毒
